Transcript 同种免疫性血小板减少症诊断新方法

同种免疫性血小板减少症诊断
新方法
Dr. Sentot Santoso PhD
血小板输注讨论会
中国 ·广州
2009.4.27-4.30
同种免疫性血小板减少综合症
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胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少 (FNAIT)
血小板输注无效
输注后紫癜
被动性血小板减少症
移植相关性血小板减少
FAINT的发病机制
人类血小板同种抗原
新的人类血小板同种抗原
中国人群的人类血小板同种抗原
中国人群的人类血小板同种抗原表统计
同种免疫性血小板减少症的诊
断学
抗原测定
表型（PIFT, MAIPA）
基因分型（PCR-RFLP, PCR-SSP, TaqMan）
特异血清，血小板及罕见的HPA基因型
抗体测定
结合测定（PIFT, ELISA, Flowcytometry）
糖蛋白特异免疫测定法(MAIPA血小板抗原单克隆抗体固定法)
新一代血小板抗体试验？
问题
• 我们如何改进同种免疫性血小板减少症的
诊断呢？
以稳定的细胞系为来源的DNA产品
和血小板同种抗原
• 基因分型，来自于人类血小板同种抗原的
表型的献血者的Ｂ淋巴细胞系
• 抗体鉴定，转染的CHO细胞稳定表达的人
类血小板同种抗原
以Ｂ淋巴细胞系作为来源获得标准
DNA
人类血小板同种抗原基因分型的
Ｂ淋巴细胞系
ISTH/ISBT血小板基因型鉴定实验室
特异等位片段细胞系表达人类血小
板同种抗原
被转染的CHO细胞表达
ＨＰＡｓ
鉴定低频抗原HPA-8bw,-11bw,13bw引起的同种免疫反应
问题
血小板抗体测定是否可以进一步改善？
血小板抗体测定的进展
血小板抗原单克隆抗体固定法
（ＭＡＩＰＡ）
ＭＡＩＰＡ测定的步骤
抗原捕获测定的优点和缺点
新的血小板抗体测定？
（１）
w/o the use of mab
w/o the
use
of whole
platelets
w/o any washing step
快速、敏感、特异、可靠
新的血小板抗体测定？
（２）
• 某些血小板同种异体抗体，用现有的技术
是检测不到的
漏检anti-HPA-1a 的胎儿与母亲不相容
的疑似ＦＮＡＩＴ
抗体检测的影响因素
• 血小板抗原
三维结构 密度 表位
• 血小板抗体
浓度 亲和力 异质性
• 其他因素（比如说：配体）
血小板糖蛋白IIb/IIIa
的构象
两种类型HPA-1a 的同种异体抗体
抗原密度
异种表位：单克隆抗体
抗体表达的稳定性
新的血小板抗体测定方法
重组血小板抗原在ELISA体系中的
应用
在昆虫细胞中可溶的重组人类血小
板抗原产品
可溶性重组HPA-1a and -1b
用rGPIIIa抗体
检测anti-HPA-1a（ ELISA）
凝胶抗原特异测定(GASA)
血小板抗体测定：
MAIPA vs. GASA
抗原-抗体的“锁与钥匙”的概念
新的血小板抗体测定方法
纯化血小板抗原或者重组血小板抗原
在SPR（表面激元共振，Surface
Plasmon Resonance,SPR)中的应用
借助SPR技术的抗原-抗体相互作用
的实时分析
表面等离激元（SPR）
实时蛋白质-蛋白质交互作用
在SPR中用Mabs 的HPA-1a and
HPA-1b 抗原的反应
SPR技术的原则
MabSZ21: HPA-1a “Specific”
单克隆抗体SZ-21 和抗PlA1 抗体的竞争性结
合及这种结合潜在的临床应用
Xi X，Zhao Y，Jiang H，Wu Q，LI P，
RUAN C
中国 ·江苏血液研究所 、苏州医科大学
Nouv Rev Fr Hematol.1992;34(3):239-42
Mab SZ21 (HPA-1a类似体) 与固定的
HPA-1a and HPA-1b 抗原在SPR中的
反应
严重的NAIT 病例中低亲和力的HPA1a 同种异体抗体（1）
严重的NAIT 病例中低亲和力的HPA1a 同种异体抗体（2）
严重的NAIT 病例中低亲和力的HPA1a 同种异体抗体（3）
人类血小板抗体的分析
动物模型？
抗体介导的血小板清除和相关
抑制因子的测定
以NOD/SCID 鼠作为
模型进行人类血小板抗体的研究
在NOD/SCID 鼠体内循环期间人类血
小板存活的动力学
FNAIT
的病理机制
Mab SZ21 抑制体内的HPA-1a 同种异
体抗体介导的血小板清除？
Mab SZ21 抑制体外的HPA-1a 同种异
体抗体与人类血小板的结合
Mab SZ21 抑制体内的HPA-1a 同种异
体抗体介导的血小板清除
结论
• 基于在分子生物学基础上的HPA的第四代基因分
型技术的发展，此技术可以进行快速的ＨＰＡ基
因分型。参照DNA来源于永生化细胞系，可以用
于基因分型的质量控制
• 但是，抗体的检查依然个难题。新一代的血小板
抗体检测的应用（SPR技术）势在必行
• 对于新一代的血小板抗体检测技术，检测自然抗
原，表位的复杂性，抗体的异质性等附加条件的
要求是十分重要
• 体内试验可以研究致病的抗体和免疫介导的血小
板减少症的病理机制。动物模型对于药物检测的
研究必不可少
新一代血小板抗体测定？
致谢
1、 Justus Liebig University 和临床免疫输注医学
研究所 （Giessen, 德国）
Ines Socher ， Cornelia Andrei-Selmer ，Tamam
Bakchoul，Ulrich Sachs，Hartmut Kroll
2、剑桥大学和国家健康服务血液移植（英国）
PrachiStafford， Cedric Ghevaert ，Willem
Ouwehand
3、血液研究所 ，（密尔沃， 基威斯康星， 美国）
Peter Newman，Brian Boylan
抗HPA-1a 水平和NAIT严重程度
之间的关系