Transcript 1.Táptalajok, tenyésztési módszerek. Élősejtszám meghatározás

Élősejtszám meghatározás
1. gyakorlat
Mikrobaszám meghatározási
módszerek


Összes mikrobák (élő és holt együttes)
számának meghatározására alkalmas
módszerek
Élő (tenyészthető) mikrobák számának
meghatározására alkalmas módszerek
Élő mikrobaszám meghatározási
módszerek

Szilárd táptalaj alkalmazásával
–
–
–

Lemezöntés
Szélesztés
Membránszűrés
Folyékony táptalaj alkalmazásával
–
MPN
Táptalajok
Csoportosításuk
1.
2.
3.
Halmazállapot szerint
Összetevők szerint
Alkalmazásuk szerint
1. Halmazállapot szerint

Folyékony

Szilárd
–
–
–

Agar (olvadáspont: ~90 °C, dermedéspont: ~40°C)
Zselatin
Szilikagél
Félfolyékony
2. Összetevők szerint



Természetes: természetes anyagok
felhasználásával készülnek, ezért összetételük
pontosan nem definiálható
Szintetikus: minden összetevőjét kvantitatíve és
kvalitatíve is ismerjük
Félszintetikus: minden agart tartalmazó táptalaj
Táptalajok összetevői

Víz: vízaktivitás szerepe a szaporodásban

Szénforrások:
CO2 – csak autotróf mikroorganizmusok
– szénhidrátok, mono-, oligo- és poliszaharidok
– Húskivonat, pepton (N-források is)
 Nitrogén források:
– N2 – Rhizobium és Azotobacter species
– Szerves:
–




–
Húskivonat,
proteinek (tej, szója),
peptonok,
amino savak
Szervetlen:



Ammonium sók: (NH4)2SO4
Nitrátok: KNO3, NaNO3
Nitritek: KNO2, NaNO2
Táptalajok összetevői

Ásványi anyagok:
–
–

Vitaminok, biosz anyagok:
–

Kationok: K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+
Anionok: PO43-, HPO42-, H2PO4-, Cl-, CO32-, HCO3Élesztő kivonat
Speciális kiegészítők
3. Felhasználás módja szerint





Általános
Elektív
Szelektív
Differenciáló
Speciális
Általános (alap) táptalajok
Olyan táptalajok, amelyek összetételüknél fogva
általánosan (de nem univerzálisan) használhatók.
A szaporodáshoz szükséges tápanyagokon kívül más
speciális anyagot nem tartalmaznak.
Elektív táptalajok
Olyan táptalajok, amelyek összetételüknél fogva csak
bizonyos mikrobacsoportok minimális
tápanyagigényét elégik ki, így azok a
környezetükben élő kísérő mikroflórából
kiemelhetők.
Szelektív táptalajok
Olyan kiegészítő komponenst tartalmaznak,amelyek
egyes mikrobacsoportok szaporodását gátolják (pl.
antibiotikumok, festékek,szulfonamidok stb.).
Gyakran tartalmaznak olyan alkotókat is, amelyek a
keresett, mikrobacsoport szaporodását segítik.
A szelektív táptalajok közétartoznak a módosított
pH-jú (erősen savas vagy lúgos) táptalajok is.
Differenciáló táptalajok
A mikroorganizmusok differenciálására, azonosítására
szolgáló táptalajok, amelyek kémiai indikátort, vagy
egyéb jelzőrendszert (pl. Durham-féle fermentációs
cső) tartalmaznak, amely speciális reakciókat (pl.
savtermelést) jelez.
Jellemzőjük, hogy egyes komponenseik szabad
szemmel is látható reakciót adnak a
mikroorganizmusok bizonyos anyagcseretermékeivel
vagy enzimeivel.
Jellegzetes képviselőik a kromogén és fluorogén
táptalajok
Chromocult® Coliform Agar (Merck)
sötétkék: E. coli, rózsaszín: Coliformok
Speciális táptalajok
Különböző vizsgálati céllal összeállított, különleges
vizsgálatokat szolgáló tápközegek.
Mikroba tenyésztési módszerek
Tenyésztés szilárd táptalajon
Alap feltételezés: minden egyes mikroba
képes növekedni és különálló, látható
telepet képez.
Tenyésztés folyékony táptalajban
Alap feltételezés: minden egyes mikroba
képes növekedni és a táptalajban látható
elváltozást okoz
Táptalajok beoltása
Oltási módszerek:
–
–
–
Táptalajba keverés
Szélesztés
Beszúrás
Élősejtszám meghatározási módszerek
Szilárd táptalaj

Lemezöntés
Szélesztés
Membránszűrés

Határhígítás
Folyékony táptalaj


Élősejtszám meghatározás szilárd
táptalajon 1. Hígítási sor készítése
A vizsgálandó mintából úgy kell hígítást készíteni,
hogy legyenek olyan lemezek, amelyeken a telepek
megszámolhatók (max. 300 telep/Petri-csésze)


Általában 10-es alapú hígítási sor
Az első hígítás általában 10 g minta + 90 ml hígító
folyadék, amelyet megfelelő módon homogenizálni
kell
–
–
–

Stomacher
Késes homogenizáló
Egyéb
A további hígítási tagok: 1 + 9 ml
Hígító folyadékok



Fiziológiás konyhasó oldat
Sós pepton
Peptonvíz
A hígító folyadék nem változtathatja meg a táptalaj
szelektivitását!
Hígítási sor készítése 1.
1.
2.
3.
A minta kimérése
(ált. 10 g)
A hígító folyadék
hozzáadása (90 ml)
Aprítás,
homogenizálás
Hígítási sor készítése 2.
1 ml
90 ml
+10 g
A hígítás száma:
Hígítási fok (d):
1.
10-1
1 ml
9 ml
2.
10-2
1 ml
9 ml
3.
10-3
1 ml
9 ml
4.
10-4
1 ml
9 ml
9 ml
5.
10-5
6.
10-6
Lemezöntés
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Hígítási sort készítünk
Minden hígítási tagból 1 ml-t mérünk (steril) pipettával a (steril,
általában 90 mm átmérőjű) Petri-csészébe
A Petri-csészékbe 18-20 ml, felolvasztott és kb. 45 °C-ra visszahűtöt
táptalajt öntünk. (Az agar vastagsága ~3 mm)
Alaposan (váltakozó irányú, körkörös mozgatással) elkeverjük
Hűtjük megszilárdulásig
Inkubáljuk az előírt hőmérsékleten és ideig (fedéllel lefelé!)
A lemezeken megszámoljuk a kinőtt telepeket
Ha a mikroba hajlamos a szétfutásra (pl. Proteus), a táptalajt megszilárdulás
után felülrétegezzük tiszta agarral, vagy a felhasznált táptalajjal (~5 ml)
Szélesztés
1.
2.
3.
4.
5.
Hígítási sor készítése
Az előre megszilárdított és páramentesített lemezek
felületére 0,1 ml-t felcseppentünk
A cseppet a felületen steril üveg, vagy műanyag eszközzel
elszélesztjük, úgy hogy a steril eszközzel az agar-lemez teljes
felületén szétkenjük, majd a lemezt 90 °-kal elforgatva a
műveletet többször megismételjük, anélkül, hogy hozzáérnénk
a Petri-csésze falához
Inkubáljuk az előírt hőmérsékleten és ideig (fedéllel lefelé!)
A lemezeken megszámoljuk a kinőtt telepeket
Abban az esetben, ha kis mikrobaszámot kell meghatároznunk
szélesztéssel, 1 ml-t szélesztünk 140 mm átmérőjű Petri-csésze
felületén, vagy 3 db 90 mm-es Petri-csészén
Membránszűrés

Alkalmazása:
–
–
–


Szűrhető folyadékokban (pl. víz, üdítőitalok) kis
mikrobaszámok meghatározására
Mikrobaszaporodást gátló anyagot tartalmazó folyadékok
mikrobaszámának meghatározására
Szűrhető folyadékok sterilitásának vizsgálatára
Élelmiszeriparban általában 47 mm átmérőjű, 0,45 µm
pórusméretű membránt használunk
A leszűrendő folyadék minimális mennyiségét úgy kell
megválasztani, hogy az a membrán teljes felületén
szétterüljön (ált. min. 10 ml), maximális mennyiségét,
úgy, hogy a membrán pórusait ne tömje el, illetve a
szűrés ideje alatt a membrán ne szakadjon el
Membránszűrés






Felhelyezzük a steril membránt a membránszűrő
készülékre
Rácsavarjuk a tölcsért
A szűrendő folyadék megfelelő mennyiségét a
tölcsérbe öntjük
Bekapcsoljuk a vákuumot
A szűrés befejeztével a membránt a táptalajra
helyezzük, úgy, hogy a mikrobák felül legyenek
A szűrőlapot úgy kell táptalajra tenni, hogy ne
maradjon alatta légbuborék
Folyadék tenyésztés
Alkalmazása:
–
–
–
Kis mikrobaszám meghatározására
Speciális mikrobák kimutatására, vagy dúsítására
Speciális mikrobák számának meghatározására abban az esetben, ha
nincs megfelelően szelektív szilárd táptalaj
Általában egyes mikrobák, vagy mikrobacsoportok
meghatározására használjuk, sokszor úgy, hogy a nem
kívánt mikrobák szaporodását szelektíven gátoljuk
Egyértelműen meg kell határozni, hogy mit tekintünk pozitív
reakciónak (pl. zavarosodás, gázképződés, színváltozás,
stb.) Csak pozitív vagy negatív eredmény lehetséges, a
legvalószínűbb mikrobaszám (MPN) meghatározásához
statisztikai módszereket (táblázatok) kell alkalmazni.
Hígítási sor készítése
1 ml
90 ml
+10 g
A hígítás száma:
Hígítási fok (d):
1.
10-1
1 ml
9 ml
2.
10-2
1 ml
9 ml
3.
10-3
1 ml
9 ml
4.
10-4
1 ml
9 ml
9 ml
5.
10-5
6.
10-6
Beoltás


Minden hígításból 3 csőbe oltunk
A mintát úgy kell hígítani, hogy az utolsó
hígítás(ok), negatív(ak) legyen(ek)
Beoltás
1 ml
1 ml
90 ml
+10 g
A hígítás száma:
Hígítási fok (d):
9 ml
1.
10-1
1 ml
9 ml
2.
10-2
1 ml
9 ml
9 ml
3
10-3
4.
10-4
5.
10-5
Inkubálás
Általában a beoltást (megszilárdulást,
adszorpciót) követően azonnal megkezdjük
az előírt hőmérsékleten (a megengedetett
eltérés ±1 °C)
Az inkubálási idő letelte után azonnal
megvizsgáljuk (értékeljük) a lemezeket