Transcript Aula_11 - Genética

Genômica e Proteômica
O que é Genômica ?
 Subdivisão da genética de mapeamento, sequenciamento e análise do
funcionamento de genomas inteiros (Thomas Roderick, 1986)
 Revista Genômica
1) Estrutural
 Visa a caracterização física do genoma
2) Funcional
 Caracterização do Transcriptoma (transcritos produzido)
 Caracterização do Proteoma (proteínas codificadas)
1) Genômica Estrutural
Mapas Cromossômicos: Níveis crescentes de resolução
Atribuição de loci a
cromossomos específicos
localização destes loci
nos cromossomos
obtenção das sequências
nucleotídicas destes loci
Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural
Mapeamento Meiótico por Recombinação
 Baseado na análise da frequência de recombinantes
 Inicialmente utilizava-se marcadores fenotípicos qualitativos
Limitações: - precisa realizar cruzamentos controlados
- necessidade de obtenção de um grande número de descendentes
 É aplicado principalmente a organismos experimentais
(Drosophila, Arabidopsis, Neurospora, etc)
 Nestes organismos, existem muitos marcadores fenotípicos já mapeados
 Entretanto, intervalos entre marcadores ainda era grande
 Intervalos não podiam ser mapeados por análise de ligação pois não haviam outros
marcadores nestas regiões
Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural
Mapeamento Meiótico por Recombinação
Marcadores Moleculares
 Sítio de heterozigose para algum tipo de variação neutra de DNA
 Preenchem os intervalos entre os marcadores fenotípicos
 RFLPs (Restriction Fragment-Length Polymorphisms)
 Minissatélite
 Microssatélite
 RAPDs (Randonly Amplified Polymorphic DNAs)
 AFLPs (Amplified Fragment-Length Polymorphisms)
 SSCPs (Single-Strand Conformational Polymorphisms)
 DGGEs (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
 SNPs (Single Nucleotide Polymorphysms)
Ex. 1: Uso de marcadores Microssatélite
Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural
Posicionamento de loci em Mapas Citológicos:
Hibridização in situ
Marcação com sonda radioativa
(cromossomo politênico de
Drosophila)
Marcação com sonda
fluorescente – FISH
(Cromossomo humano 11)
1) Genômica Estrutural
Mapeamento Físico
 É assim chamado pois é obtido pela manipulação direta de fragmentos de DNA,
material físico do genoma
 Meta: identificar um conjunto de fragmentos clonados superpostos que englobem
todo o cromossomo ou o genoma
Biblioteca genômica
Clones
RFLP
Grupos superpostos de clones (contigs)
Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural
Mapeamento Físico
Ordenamento dos clones por clivagem com enzimas de restrição
1) Genômica Estrutural
Mapeamento Físico: Ordenamento por FISH
Marcação com sonda fluorescente – FISH
(Cromossomo humano 11)
Marcação com sonda fluorescente - FISH
Ordenamento dos
clones por FISH
Mapa
MapaCitológico
Citológico
cromossomo
cromossomo11
11
Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural
Mapa de Ultra-Estrutura: Sequenciamento
Estratégias:
1) Sequenciamento aleatório de clones:
2) Sequenciamento de clones ordenados
1) Sequenciamento aleatório de clones:
- DNA é fracionado e clonado aleatóriamente
- As pontas dos clones são sequenciadas
- As regiões sequenciadas são usadas para ordenar os clones
2) Sequenciamento de clones ordenados
clones em YAC ordenados
subclonagem em BACs
BACs são novamente ordenados (STS)
subclonagem de inserções menores
sequenciamento aleatório dos clones
Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional

Dados de sequências em larga escala são o começo da genômica funcional

Algumas das análises que podem ser feitas:
a)
Caracterização do proteoma por análise de ORFs
b)
Perturbação gênica por nocaute
c)
Silenciamento gênico por Interferência do RNA
d)
Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido
e)
Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA
f)
Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas
a) Caracterização do proteoma por análise de ORF (sequências abertas de leitura)
 Softwares de previsão analisam as sequências de DNA
- Examinam os 6 possíveis quadros de leitura
- Buscam sequências com códons de início e término de tradução
- Análise da função da ORF através da busca por sequências homólogas
em bancos de dados
Ex.: Distribuição provisória dos genes pode ser deduzida
Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional
b) Perturbação gênica por nocaute
 Investiga a função da ORF
 Inativação do gene (nocaute) por mutagenese in vitro
 procura de qualquer fenótipo mutante
 Mais da metade das ORFs inativadas não apresentam efeitos fenotípicos
c) Silenciamento gênico por interferência do RNA (RNAi)
 Investiga a função da ORF
 Duplas fitas de RNA são reconhecidas e clivadas.
 Silencia o gene
 procura de qualquer fenótipo mutante
Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional
d) Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido
 Investiga a interação entre proteínas
 Proteína GAL4 de leveduras tem 2 domínios: a) ligação ao DNA
b) ativação
Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional
e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA
 Avalia a expressão gênica em organismos, tecidos ou células em diferentes
situações fisiológicas ou patológica
 Analisa o nível de expressão de milhares de genes simultaneamente
 Necessita confirmação posterior por Northern-blotting ou RT-PCR Quantitativo.
Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional
f) Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas
 Fusão traducional entre o gene de interesse e a proteína GFP
 Monitora a sintese e localização de proteínas específicas in vivo
Genômica e Proteômica