Transcript Cu +1 - Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Centro de Ciências Biológicas
Programa de Bolsas REUNI
Proteômica
Florianópolis, 23 de novembro de 2010
Proteômica
A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA.
Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto
é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo, podendo caracterizar
processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.
Proteômica
Proteômica é a técnica utilizada para identificar todas as proteínas expressas
por um genoma em um determinado tempo/espaço com o principal objetivo de elucidar
os produtos gênicos a nível protéico.
Tempo
Núcleo
Citoplasma
Membrana
Espaço
Proteômica
Proteômica
Proteômica sistemática: mapa protéico
Tecidos
Células
Compartimentos celulares
Proteômica diferencial: faz análise das
modificações a nível protéico comparativamente
com proteínas de referência
Desenvolvimento
Interações
hospedeiros
Tratamentos
entre
microorganismos
e
Áreas de pesquisa : Caracterização do câncer
Área de pesquisa : Neuroproteômica – Caracterização do cérebro humano
1999 Proteoma
do cérebro de
camundongo
2004 Proteoma
de hipocampo
humano
2001 Foi proposto pela
HUPO a caracterização
do Proteoma humano
sob condições normais e
patológicas
2005 Proteoma do
complexo NMDA de
camundongo
em
resposta à fármacos
2005 Proteoma do
cérebro de rato
2005 Proteoma de
M.P de hipocampo
de camundongo
2008 Proteoma
de hipocampo de
rato sob exercício
2006 Proteoma
do hipocampo de
camundongo
Revistas
Etapas metodológicas
Principais etapas metodológicas
Tratamento do animal
Extração das proteínas
Focalização isoelétrica
Eletroforese em gel 2-DE
Digestão in gel
Espectrometria de massa
Isolamento de proteinas
Extração da amostra
Precipitado é re-extraído
Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento.
Tampão de lise:
Lise mecânica da
célula
Homogenato de
ptns em gelo por
20 min
Centrifugação 30
min a 12000 x g a
4º C
Estratégias
a serem tomadas: manter a amostra na menor
25 mM Tris HCl pH 7,2
10 mM CHAPS
temperatura
possível e utilizar o protocolo mais simples para
0,5 M NaCl
evitar
perda
5% glicerol
(v/v) protéica.
1 mM PMSF
SN1+ SN2
Proteínas
nucleares
Proteínas
citoplasmáticas
Proteínas
membranares
Quantificação das proteínas com 2D Quant Kit
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS : Bradford, Biureto, Lowry e Smith ou BCA.
Solução com Íon
cúprico (Cu+1)
Proteínas totais
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Cu+1
Agente
colorimétrico
480 nm
Limpeza da amostra com Clean up Kit
MÉTODOS BCA:
Solução
precipitante
100 ug /ul de
proteína
Centrifugação
Pellet de
Proteína pura
Ressuspensão das
ptns em 250uL
tampão
de
reihidratação:
7 M Uréia
2 M Tiuréia
2%(p/v) CHAPS
0.5% de IPG buffer
pH 3-10
18 mM DTT
Baseada na precipitação
por TCA
Diversas moléculas são
eliminadas:
-DNA, lipídeos
- Sais, detergentes
0,001% azul
bromofeno
de
Solubilização da amostra
Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia
Agentes Surfactantes: CHAPS
Agentes redutores: DTT
Hidratação do strip
Tiras de strip de 13 cm
imobilizado com pH 3-10
Focalicalização isoelétrica (IEF)
Strips foram
removidos
Ajuste dos
eletrodos
Cerâmica IEF
Total: 15500 V/h e
25 uA/strip
Strips foram
posicionados
Ettan IPGphor 3
Paper Pads
umedecidos
Eletroforese em gel bidimensional (2D)
1º DTT
Separação das
proteínas por pI
2º Iodoacetamida
Gel poliacrilamida
12,5%
Cuba vertical
Hoefer SE Ruby
Fixação:
8% de
ácido fosfórico, 50%
de etanol por 1 hora
Separação das ptns
por massa
Coloração: Coomassie
Blue G-250 por 24h
Proteínas separadas por
pI e massa
Separação de proteínas com eletroforese em gel 2D
Análise simultânea de diversas proteínas
.
 Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições
diferentes.
Análise das imagens no gel
Volume dos spots:
permitindo uma
quantificação relativa
Presença ou
Ausência de
spots
Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)
Digestão in gel
Excisão dos spots
Descoloração:
Tripsinização
25 mM bicarbonato de
amônio e 50%
acetonitrila
(entre os resíduos de
lisina e arginina)
Peptídeos
são secos à
vácuo
Extração de petídeos:
50% de acetonitrila e 5%
trifluoroacético
Estocagem a
-20ºC
Identificação das proteínas por Espectrometria de Massa
Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa
molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos.
Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de
dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas.
Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações póstraducionais das proteínas.
Sistema à vácuo
Amostras 2DE
Fonte de
ionização
Analisador
de massa
Detector
Espectômetro de Massa
Peptídeos são
homogenizados com
pequenos compostos
orgânicos
Estes compostos reagem
com a matriz orgânica
ácido -ciano-4hidroxicinâmico
Peptídios são
ionizados
Os íons são
dessorvidos
Espectômetro de Massa
Os íons são acelerados alcançando
alta energia cinética
Colisão dos íons ao detector
As massas dos fragmentos são
separadas e detectadas
As massas digeridas dos peptídeos são comparadas com uma lista de massas teóricas de peptídeos oriundas das
ORFs do banco de dados do genoma de um organismo
Espectômetro de Massa
Identificação de cada proteína do mapa proteômico
Proteômica
Array-based protein interaction detection
Array-based protein interaction detection
Protein microarrays
Proteomicworld.com