Transcript E. coli

Quiz ครั้งที่ 3 : เวลา 10 นาที
1. ใน Translation ของ Prokaryote บน mRNA มี docking site
สาหรับ ribosome คือ (1)………….
2. ใน Translation ของ Eukaryote บน mRNA มี docking site
สาหรับ ribosome คือ (2)………….
3. tRNA ที่ ใช้เริ่ ม translation คือ(3) ……………
4. ใน ribosome สามารถรับ tRNA ได้ที่ (4)…………..และ
(5)…………….
5. Start codon คือ (6)………………….
6. Stop codons คือ (7) ……… , (8) .…… , และ (9)
...……
7. Factor ที่ recognize stop codons ได้คือ (10) …………...
ขอเปลี่ยนแปลงวันสอบ Midterm ครั้งที่ 2
กาหนดเดิม:
เสาร์ที่ 25 พ.ย.
เปลี่ยนเป็ น
เสาร์ที่ 2 ธ.ค.
(9:00-12:00 น.)
Gene Mutation
&
Repair
Mutation
กระบวนการเปลี่ยนโครงสร้างของ Genes
ทาให้เกิด Alternative forms ของ genes
ผล - เปลี่ยน Phenotype หรื อไม่เปลี่ยน
- เกิด Biodiversity
- ใช้ศึกษา การควบคุมพันธุกรรม
Mutation เป็ นลักษณะอย่างหนึ่งของ gene
 Alternative forms of genes
 Change ใน phenotypes
 Biological diversity
 Genetic study
Types of Mutation
I. Effects on the Phenotype of
Mutant Organisms
II. Effects on the Genetic
Materials
I. Effects on the Phenotype of Mutant
Organisms
1. Somatic & Germ-line Mutations
2. Morphological Mutations
3. Nutrition Mutations
4. Lethal Mutations
5. Condition Mutations
1. Somatic & Germ-line Mutations
1.1 Germ-line mutation : sex cells, progeny
e.g. Queen Victoria of Great Britain hemophilia
1.2 Somatic mutation : nonsex cells, within
lifetime of individual
e.g. Indian corn --> transposable genetic
element
1.1 Germ-line mutation : sex cells, progeny
1.2 Somatic mutation : nonsex cells, within
lifetime of individual
2. Morphological or Visible mutation
Appearance ต่างจาก wild type
e.g. - albino mammal
- สี ตา & ลักษณะปี กของแมลงหวี่
- colony ของ bacteria/yeas, plaque
ของ virus
Visible mutation
3. Nutrition mutation :
Microbes wild-type เจริ ญได้ใน minimal media
เรี ยกว่า Prototrophs
Mutant เจริ ญใน minimal media ไม่ได้ ต้องการ
extra substances เรี ยก Auxotrophs เพราะ defective
genes / ขาด enzymes สร้างสารและพลังงานจาก
glucose และ salt เพื่อดารงชีพไม่ได้ ต้องมีอาหาร
พิเศษ
เช่น bio mutant E.coli
ต้องการ biotin
leu mutant E.coli ต้องการ leucine
pantothenateless mutant Neurospora
ต้องการ pantothenate
4. Lethal mutation : death
mutation ใน gene ของ subunits ของ
RNA Polymerase --> inactive RNA Pol -->
no transcription --> no RNA
4.1 Lethal mutation ใน haploid
organisms
ตายทันที เพราะ ไม่มี wild-type gene / allele
ที่ผลิต RNA Polymerase
เพื่อ
compensate
4.2 Lethal mutation ใน diploid organisms
มี wild-type allele ปกปิ ดไว้ไม่แสดงผลร้ายได้หลาย
รุ่ น จนกว่า heterozygous mate --> Lethal เช่น
yellow mice
- heterozygous --> survive
- homozygous --> ไม่เคยมีปรากฏเพราะ
ตายในท้องแม่และเป็ น recessive
5. Condition mutation
mutation แล้วมี condition เป็ น lethal หรื อไม่
5.1 Conditional lethal
5.1.1 Temperature-sensitive (ts)
normal growth temperature = Restrictive หรื อ
Non permissive
allowed growth temperature = Permissive
mutants ที่ grow ใน restrictive ไม่ได้ เพราะ
mutated protein ถูก denatured --> lethal จึง
เป็ น Temperature-sensitive mutants
ตัวอย่าง ovalbumin :
ในไข่ --> restrictive/ nonpermissive
low temperature --> permissive
bioled egg --> sensitive --> denatured --> lethal
5.1.2 Premature translation
normal codons mutate เป็ น stop codon(s) ภายใน
reading frame ของ gene
- survive ถ้ามี supressor tRNA --> mature translation
- lethat ถ้าไม่มี suprresor tRNA --> premature
translation
5.2 Condition without lethal
Temperature-sensitive coat color gene ของ แมวไทย
Body : warm --> inactivate color-producing
enzyme --> white color
Feet, nose, & ears : cool --> produce enzyme -> dark color
II. Effects on the Genetic Materials
1. Point Mutations
2. Silent Mutations
3. Frameshift Mutations
4. Reversion Mutations
1. Point Mutations
mutation เกิดกับ 1 หรื อ 2-3
bases
เปลี่ยนแปลง base โดย
- alteration หรื อ
- insertion หรื อ
- deletion
ให้เกิดการเปลี่ยนแปลงกับ
codon และ
reading frame ของ codon
Point mutation
1.1 Missense Mutations
เปลี่ยน 1 base ทาให้เปลี่ยน sence ของ codon
จาก a.a. หนึ่งเป็ นอีก a.a. หนึ่ง เช่น
1.2 Nonsense Mutations
convert sense codon ให้เป็ น stop codon
tryptophan codon UGG --> stop codon UGA
ใน translation ไม่มี tRAN recognize ได้มีแต่ RF
recognize stop codon ได้ premature translation
--> protein ผิดปกติ
1.3 Transition Mutation
เปลี่ยนในกลุ่ม base เดียวกัน
pyrimidine replace pyrimidine
purine replace purine
1.4 Transversion Mutation
เปลี่ยนสลับกลุ่ม base
pyrimidine replace purine
purine replace pyrimidine
2. Silent mutation
mutation ที่ detect ไม่ได้โดยวิธีธรรมดา
เปลี่ยน base ของ codon UCA เป็ น codon UCG
ทั้ง 2 codons คง code ให้ serine
protein ชนิดเดิม
mutation ที่ 3rd base/wobble position ของ
codon
mutation ภายใน intron จะสะสม ให้ลูกหลาน
Silence mutation
3. Frameshift mutation
Insertion หรื อ Deletion 1 base เปลี่ยน reading
frame ชุดใหม่ของ gene นับจากตาแหน่ง mutation
เป็ นต้นไป codon เปลี่ยน ---> useless protein
stop codon ---> immature protein
ไม่มี stop codon ---> readthrough
เป็ นผลให้ได้ mutant phenotype
Frameshift mutation
4.
Reversion หรือ Backmutation
mutation ที่ reversible ให้กลับไปยัง
original phenotype เกิดได้ 2 ทาง
4.1 True reversion
4.2 second-site reversion
(Forward mutation or Suppression)
Reversion mutation
4.1 True reversion mutation
alteration ของ mutated base กลับไปเหมือนเดิม
ทุกอย่าง หรื อ restore original reading frame
เช่น
Ser Pro Gln Gly Thr
original frame : TCC CCC CAA GGC ACT
Ser Pro Pro Arg His
insert one C : TCC CCC CCA AGG CAC T
Ser Pro Gln Gly Thr
delete one C : TCC CCC CAA GGC ACT
4.2 Second-site reversion /
Suppression
เป็ นการ mutate ครั้งที่ 2 ที่อีก codon
หนึ่ง
ไม่ให้ original gene แต่ restore function
ของ protein
mutate ให้ amino acid ใหม่ อีก
ตัว
แล้วทาให้ function ของ protein
เหมือนก่อน mutation ครั้งแรก
4.2.1 Intragenic suppression mutation
mutation แรกกับ mutation 2 เกิดใน gene เดียวกัน
เพื่อ compensate กันได้ protein ที่ function กลับคืน
4.2.2 Intergenic suppression mutation
เกิดต่าง genes แต่ compensate กัน เช่น
mutation ที่ codon บน mRNA --> mutated codon
--> a.a. เปลี่ยน
mutation ที่ anticodon บน tRNA --> complement
หรื อ suppress ต่อ mutant codon -> translation
ปกติ
ได้ protein ที่ยาวเท่าเดิม แต่มี a.a. 1 ตัวไม่
ถูกต้อง
mutation ที่ codon ของ mRNA อาจเป็ น
Missence mutant หรื อNonsence mutant ก็ได้
mutation ที่ anticodon บน tRNA ได้ mutant เป็ น
suppressor ต่อ mutant codon mRNA
Nonsense mutant
Suppressor mutant
Ochre mutant - UAA
Ochre suppressor
Amber mutant - UAG
Amber suppressor
Opal mutant - UGA
Opal suppressor
Causes of Mutations
1. Spontaneous Mutations
2. Chemical Mutations
3. Radiation-induced Mutations
Mutagens = mutation causing agents
1. Spontaneous mutations
mutation เกิดเอง ไม่มี mutagens
8
ใน bacterial cell เกิดทุก ๆ 1 cell ใน 10 cell divisions
ในคน spontaneous rate mutation ยิง่ สูงกว่า มักเกิด
อย่าง random โดยเป็ น errow ของ DNA replication ที่
เล็ดลอด proofreading function ของ replicating
enzymes
Spontaneous mutation เกิดจากหลายสาเหตุ
1.1 DNA replication machinery
E.coli mutant strains มี unfaithful replication
เรี ยกว่า Mutators
Gene ของ DNA Polymerase encode ให้ mutant
subunits --> mismatch repair และ proofreading
ไม่ได้ ใน replication
rate mutation ของ mutator สูงกว่าปกติและ
mutator adapt ต่อ environment ได้ดี
1.2 Replication mistakes โดย DNA
bases
base ของ DNA มี form / Tautomer 2
forms
มีโครงสร้างหลักของ atom เหมือนเดิมแต่ การเรี ยง
base ต่างกันเล็กน้อย
การเปลี่ยน form ของ base เรี ยกว่า
Tautomerization
หรื อ Tautomeric shift
ปกติ Base แต่ละ base ของ DNA มี form เดียว
T
A
Keto form T = A amino form »¡µÔ
enol form T = G keto form
amino form A = T keto form »¡µÔ
imino form A = C zmino form
pyr.
T keto
C imino
pyr.
A amino
G keto
DNA polymerase supply base เข้า alternate form
ทาให้
mismatch base pairing และ
mistakes ยังคงอยูใ่ น replication ในรอบ
ต่อไป
ทาให้เกิด mutation
1.3 Frameshift mutation during
replication insertion/deletion ระหว่าง DNA
replication
เกิด codon เปลี่ยนตั้งแต่จุดเกิด mutation เป็ นต้นไป
ยังไม่รู้ mechanism แท้จริ ง อาจเป็ น Slip a cog
โดย base pair เข้า partner ไม่ได้ looping out ติดอยู่
replication รอบต่อไปอาจ insert looping base
หรื อ delete looping base
Hypothesis of Frameshift mutation
1.4 Deamination
การเสี ย amino group ของ base หนึ่ง กลายเป็ นอีก
base หนึ่ง ทาให้ base pairing เปลี่ยนใหม่
โดยเฉพาะ cytosine และ adenine
C --> U ทาให้ G = C --> G = U
หลัง replicate ได้ GC (เดิม) และ A T (ใหม่)
[GC ==> AT]
A --> Hypoxanthine ทาให้ A = T --> H = C
หลัง replicate ได้ HC และ CG [AT ==> CG]
Deamination of Cytosine and Adenine
ในภาวะปกติ Deamination ของ C -->U
ไมเป็
่ นสาเหตุ mutation เพราะ
mismatched U จะถูกตัดออก ทาให้ G ว่างไม่มี
คู่ pair
C ถูกนามาใส่ กลับที่วา่ ง จะได้ G = C คืน
แต่ ถ้ามี methylation C ถูก methylated ได้ 5methylcytosine แล้วถูก deaminated ได้ T
G = T mismatch pair
หลัง replication ไดั G = C wild-type
A = T mutant
CG เป็ น target สาหรับ methylation และ 5methylcytosine เป็ น Hot spot สาหรับ
Spontaneous mutation
Deamination of methylated Cytosine
2. Chemical mutagenesis
Mutation โดย chemicals และ radiation
เกิดบ่อยกว่า spontaneous mutation
Chemicals บางอย่าง accelerate อัตรา mutation
หรื อinduced mutation
chemicals นั้นเรี ยก Mutagens
เช่น mutagens และ UV ช่วยเร่ ง spontaneous
mutation
2.1 Base analogues
เสริ ม frequency ของ tautomerization เช่น 5’bromodeoxyuridine (BrdU) คล้าย Thymidine
BrdU = A แต่ถา้ BrdU ---> enol tautomer ==> C
BrdU = G ซึ่ง frequency สูงกว่า tautomerization
ของ thymidine
e.q. สารเร่ ง tautomerization คือ nitrous acid,
bisulfite
Base analogue
2.2 Alkylation
environmental carcinogen หลายชนิด
เป็ น Electrophilic - ชอบ negative charge
จึงหา center ของ negative charge คือ DNA ซึ่งมี
PO 4
และ bases แล้ว Alkylation ใส่ Alkyl
groups เข้า DNA ที่
Phosphoduester bonds ระหว่าง 2 sugars,
N3 ของ adenine และ
N7 ของ guanine
Alkylation ไม่ทาให้ mismatch
แต่ทาให้ bond ระหว่าง base กับ sugar อ่อนแอ
base หลุดออก จาก DNA เหลือแต่ sugar เป็ น
apurinic site = ไม่มี purine base
หรื อ อาจทาให้เกิด tautomer ที่ผิด
เซลล์ตอ้ ง repair ให้ปกติก่อนจึง replicate ได้
หรื อ repair ไม่สาเร็ จ เกิด disrupt base pairing
เกิด faulty DNA replication ทาให้เกิด mutation
electrophiles / carcinogens ที่นิยมใช้ใน lab คือ
Ethylmethane sulfonate : EMS
=> transfer methyl group ให้ DNA
Ethylethane sulfonate : EES
=> transfer ethyl group ให้ DNA
Alkylation
2.3 Intercalation ของ flat molecules
สอดแทรกโมเลกุลเข้าในโมเลกุล DNA
Ethrdium bromide และ Acridine dyes เช่น proflavin
และ acridine orange insert เข้าระหว่าง flat base pairs
ของ DNA ทาให้ helix บริ เวณ insertion จะใหญ่ข้ ึน
เป็ นโอกาสให้เกิด insertion / deletion ของ base ขณะ
replication หรื อเกิด looping out process ได้
frameshift ของ reading frame
3. Radiation - induced mutations
Mutagenic radiation ที่ common ใน
ธรรมชาติ คือ Ultraviolet, gamma radiationและ
X-radiation
Radiation ต่างชนิดกัน มี energy ต่างกัน
จะ damage DNA ได้ต่างกัน
3.1
Ultraviolet radiation
UV ให้ energy อ่อน และ damage ปานกลาง
UV cross link pyrimidine bases ที่อยูต่ ิดกันบน
DNA strand เดียวกันได้ dimers ของ 2 bases
ปกติเกิด T=T เป็ น Thymine dimer ซึ่ง interrupt
base pairing, block DNA replication
DNA pol. enzymeใส่ pair ของ base T=Tไม่ได้
หรื อใส่ base อย่าง random เป็ นผลให้เกิด mutation
UV damage ต่อ DNA มาก
ที่สุดที่ Wavelength ~
260 nm ซึ่ง DNA
absorb ได้มากที่สุด และมี
มากที่สุดในแสงแดด
mutagenicity ของ UV ทา
ให้เสี ย control ของ cell
division กลายเป็ น skin
cancer
3.2 Gamma และ X ray
energy มากกว่า UV
กระทาต่อ DNA
โดยตรง
โดย ionize H2O รอบ ๆ DNA ได้ free radicals
โดยเฉพาะ free radical ที่มี O- จะ reactive
มาก
และattack DNA ทาให้ - base change
- single strand break
- double stand break
ในกรณี ของ double - stranded break และ
ของ chromosome break
damage ที่เกิดจะถูกเก็บ (severed) และ repair
ยาก
ionizing radiation จึงเป็ นทั้ง mutagen และ
เป็ น clastogen คือ ตัวทาให้แตก (breaker)
3.3 Beta ray
พลังงานน้อยกว่า r-ray และระยะทางสั้น
กว่า
แต่เมื่อรังสี ทะลุผา่ นเซลล์/เนื้อเยือ่
จะซิกแซกสะท้อนไปมา
ทาให้ทาลาย
เนื้อเยือ่
ได้มากกว่า
3.4 Heat
เป็ น the most important environmental mutagen จะ
ตัด bond ระหว่าง purine กับ sugar ได้ apurinic site
ได้ถึง 10 000 sites ใน 1 cell ของคน
DNA Repair
ซ่อมแซม damaged DNA ให้
กลับสู่ original state
DNA Repair Mechanisms
I. True repair กาจัด defective DNAทั้งหมด
1. Direct reversal mechanism หรื อ
Directly undoing DNA damage
2. Excision repair
II. Non-repair method คงเหลือ defective DNA
3. Recombination repair
4. Error-prone repair
1. Directly undoing repair / Direct reverse
1.1 UV damage repair / Light repair
Pyrimidine dimer (T=T) ที่เกิดจากแสง UV ถูกทา
ให้แยกออกจากกันแสงสว่าง (light > 300 nm)
และ photoreactivating enzyme หรื อ DNA
photolyase
DNA photolyase enzyme
จับที่ dimer แล้ว absorb
พลังงานจาก visible light
ตัด dimer ออกได้ แล้ว fill
gap ด้วย DNA pol I และ
DNA ligaseใน E. coli
และ
phage พบว่ามี phr gene
encode ให้ DNA
photolyase
DNA polymerase I มีคุณสมบัติของ
5’-> 3’ exonuclease และ
DNA polymerase activity
DNA pol I จึงสามารถ remove damage และ fill gap
ได้ในเวลาเดียวกัน เรี ยกว่า Nick translation
ซึ่งเป็ นวิธีทวั่ ไปในการ repair DNA damage ไม่เกิด
mutation
1.2 O6- methylguanine methyltransferase
6
O - mGua methyltransferase รับ methyl และ
ethyl group ออกจาก DNA โดย มี acceptor site รับ
Alkyl group sulfur ของ cysteine
enzymeไม่สามารถนากลับมาใช้ได้อีก เป็ นSuicide
enyme
repair process นี้จึงแพงมากไม่เกิดบ่อย
พบได้ต้ งั แต่ E. coli
ถึง human beings
Mechanism of O6methylguanine
methyl transferase
2. Excision repair
ซ่อมแซมโดยตัดเอา damaged DNA ออก
แล้วใส่ fresh DNA segment เข้ามาแทน
Excision repair เป็ น repair ที่เกิดมากที่สุด
และเกิดได้หลาย mechanisms
2.1 DNA Glycosylase/AP repair
โดย DNA glycosylase create AP
site ขึ้นมาก่อน
1) DNA glycosylase ตัด glycosidic bond ระหว่าง
damaged base กับ sugarได้ AP site
(Apurinic หรื อ Apyrimidinic sites)
2) Incision โดย AP site ถูก nick ด้วย
5’ AP endonuclease
(Class II AP endonuclease)
3) Excision damaged bas
โดย 2 วิธี
a. 5’ -> 3’ exonucleas หรื อ
b. 3’AP endonucleas
(Class I AP endonuclease)
ตัดหลัง AP site พอดี เอา AP
deoxpyribise phosphate ออก
4) fill gapโดยใช้ strand
ตรงข้ามเป็ น template ด้วย
DNA pol I และ DNA ligase
กรณี Pyrimidine dimer (T=T)
1) DNA glycosylase ตัด bond ระหว่าง T ตัว
แรกกับ sugar ได้ AP
site (ไม่ตดั bond
T=T)
2) 3’AP endonuclease ตัด phosphodiester
bond หลัง AP site (incision)
3) 5’AP endonuclease หรื อ 3’5’endonuclase
ตัด AP sugar (excision)
4) 5’->3’exonuclease ตัด
2-4 nucleotides รวม
ทั้งdimer ออก
5) fill gap ด้วย DNA pol I
และ DNA ligase
2.2 Repairing damage w/o creating AP
Site
repair damaged bases จานวนมาก รวมทั้ง
Thymine dimers โดยไม่มี DNA glycosylase ช่วย
ทาได้ 2 วิธี
2.2.1 one-nick pathway
2.2.2 two-nick pathway
2.2.1 One-nick pathway
1) damage-specific DNA incising enzyme
จา
bulky damage
2) cut DNA strand upstream จาก damage
3) 5’->3’ exonuclease remove damage
ออก
2-4 nucleotides
4) fill gap ด้วย DNA pol I และ DNA ligase
2.2.2 Two-nick pathway
incising enzyme nick ข้างใดข้างหนึ่งของ damaged
DNA และ remove oligonucleotides ที่มี damage
ออก แล้ว fill gap DNA pol I และ DNA ligase
ใน E. coli
มี enz เฉพาะ ชื่อ uvrABC
endonucleass เป็ น 3 polypeptides โดย uvrA
gene, uvrB gene และ uvrC gene ที่สามารถ cutได้
12-30 bases
DNA incision without AP sites
2.3 Mismatch repair
mismatch เมื่อ (1) ใส่ base ผิด (2) failure
ของ proofreading system จึงต้อง repair
เพื่อให้รู้ ความแตกต่างระหว่าง
parental strand กับ progeny strand
E.coli มี safeguard system ป้ องกัน
ปัญหานี้
*
โดยมี sequence GA TC ซึ่ง A ถูก
methylated ทุก 250 base pairs ไม่ไกล
จาก mismatch และเป็ น ฉลาก ให้กบั
parental strand
GATC เป็ น palindrome คือ strand ตรงข้ามอ่าน
GATC เหมือนกัน ในทิศ 5’->3’ เหมือนกัน
*
*
’
5 --- GA TC NNNN-------------------GA TC NNNN---3’
3’ ----NNNN CTA*G----------------- NNNN CTA*G---5’
เมื่อเกิด mismatch ตามด้วย replication เซลล์จะ
repair mismatched base ก่อนที่ ที่ A บน progeny
strand จะถูก methylate เพราะ methylation เกิดช้า
กว่า mismatch repair system
process นี้ใน eukaryote ยังไม่รู้ เพราะไม่มี
methylation
3. Recombination repair/ Post
replicative repair
เป็ น repair mechanism ที่สาคัญที่สุด เพราะต้องการ
DNA replication ก่อนจึง repair ได้
(1) Replication process
T=T dimer ทาให้ DNA replication หยุดชัว่ คราว
replication ดาเนินต่อหลัง dimer ด้วย primer ใหม่
ได้ duplex สาย 1: strand ที่มี T=T กับ strand ที่มี gap
duplex สาย 2 : complete ทั้ง 2 strands
(2) Recombination
gapped strand ของ duplex 1 cross กับ
homologue strand ซึ่งเป็ นของ duplex 2
- gapped strand ของ duplex 1 แลกเอา
nucleotides มาfill ให้เต็ม gap และ
strand ที่มี T=T คงอยู่ ซึ่งจะถูกตัดออกภายหลัง
- homologue strand ของ duplex 2 เสี ย
nucleotides เกิด เป็ น gapped strand
อันใหม่ ซึ่ง จะถูก fill ให้เต็ม
duplex 2 จะเป็ น complete duplex
Recombination repair
4. Error-prone repair
เป็ นส่ วนหนึ่งของ SOS response และ
DNA damage เป็ นตัว induce pathway
(1) mutagen หรื อ activate recA => RecA protease
(2) RecA ย่อย LexA --> LexA หลุดจาก umuDC
operon
(3) umuDC operon active -> ให้ UmuD & UmuC
(4) UmuD & UmuC ทาให้ replication ที่หยุด เพราะ มี
T=T ดาเนินการต่อ
Error-prone (SOS) repair
Http://i.am/aptech.sut