Transcript Kloroplaszt transzformálás I.

Molekuláris farming kutatása,
fejlesztése és alkalmazása növényeknél
Dr. Miskei Márton
DE, AMTC, MTK,
Kertészettudományi és Növényi
Biotechnológiai Tsz.
DNS
Az RNS virusok kivételével az élőlények örökítő anyaga a DNS
(dezoxiribonukleinsav)
A növények genomi DNS-e a sejtmagban található
kromoszómákba kondenzálódva
A növények extranukleáris DNS-e a mitokondriumokban és a
plasztiszokban található gyűrűs formában
A transzkripció és a transzláció folyamata
Géntechnológia: Növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai
változtatása molekuláris biológiai módszerekkel
GM (géntechnológiával módosított, transzgénikus) növények:
Olyan növények, melyek genetikai állományába a géntechnológia
molekuláris genetikai módszereivel idegen gént (transzgént)
juttatnak be, amely beépűl, működik és öröklődik.
A géntechnológia történeti áttekintése
1979 Az első kísérletek a növényi géntechnológiában
1980-as évek Transzformációs rendszerek kidolgozása
1983-84 Az első transzgénikus növények
Fraley és mtsai.
Horsch és mtsai.
De Block és mtsai.
A géntechnológia történeti áttekintése
1986 Az első vírus- (Powel és mtsai., Baulcombe és mtsai.), rovar- (Vaeck
és mtsai.), herbicidrezisztens (Shah és mtsai.) GM növények
1986-tól GM növény szántóföldi kísérlete (USA)
1988-tól GM növény szántóföldi kísérlete (Európa)
1994 GM növény forgalomba kerülése
A géntechnológia történeti áttekintése
Első generációs transzgénikus növények
A mezőgazdasági termelés segítése
(vírus-, gomba-, baktérium-, rovar-, herbicid reszisztencia)
Második generációs transzgénikus növények
A növények anyagcseréjének és fejlődésének módosítása
(fehérje-, zsírsav-, szénhidrát anyagcsere, érés, hímsterilitás)
Harmadik generációs transzgénikus növények
Különféle speciális anyagok előállítása
(élelmiszeripar, műanyagipar, gyógyszeripar)
„Molecular pharming”
Gyógyszeralapanyagok előállítása genetikailag módosított
növényekkel
(emberi fehérjék, antitestek, vakcinák)
Transzformáció: A transzgén bejuttatása a növénybe
Transzgén bejuttatása Agrobacterium
tumefaciens fertőzéssel
Transzgén bejuttatása
génpuskával
Transzgén bejuttatása protoplasztokba
I. Transzgén bejuttatása Agrobacterium tumefaciens
fertőzéssel
Az agrobaktériumok a kétszikü
növényeket fertőzik a sebzési
helyeken
A fertőzött növényeken
tumorképződés
Vektorok
• Extrakromoszómális DNS, baktériumokra és egysejtű gombákra
jellemző
• A jobb túlélőképességhez szükséges géneket tartalmazzák pl.:
rezisztencia gének
• Képes önállóan osztódni, így átkerül az utódsejtbe
• Génsebészeti módszerekkel egyszerűen manipulálható
Agrobaktérium-fertőzés
Ti plazmid felépítése
Nicotiana tabacum (dohány)
• Gyorsan nő, kevés törődést igenyel
• Genomja ismert
• Régóta használják a növénygenetikában
• Szöveteiből könnyen regenerálható új növény
Transzformáció
Fertőzés agrobaktérium szuszpenzióval
Szelekciós táptalajra helyezzük a
korongokat
II. Transzgén bejuttatása protoplasztokba
A növényi sejtek sejtfalát leemésztjük
A protoplaszt-szuszpenzióhoz adjuk a DNS-t
PEG (Polietilén-glikol)
kezelés
Elektroporáció
Regeneráltatás és szelekció
III. Transzgén bejuttatása génpuskával
Néhány um átmérőjű wolfram vagy arany részecskére
adszorbeált plazmid molekula
Génpuska nagy sebességgel lövi be a szövetekbe a plazmidot
A sejtfalon keresztüljutó részecskék egy része eltalálja a
sejtmagot
Integrálódik a bevitt DNS a genomba
Transzformálás
Antibiotikumot tartalmú
regenerációs táptalaj
Szelekciós táptalajra helyezzük a korongokat
Legújabb transzformációs rendszerek
Kloroplaszt transzformáció
Mitokondrium transzformáció
A gének expressziójának szabályzása
Külső szignal kapcsolja az expressziót
Az expresszió csak bizonyos szövetféleségekben indul el
Mesterséges kromoszóma
Penicillium chrysogenum antifungális
fehérje (PAF) termeltetése
transzgénikus dohány (Nicotiana
tabacum) növényben
Bevezetés
• növény transzformálás
– harmadik generációs transzgénikus növények
– fehérje termeltetés növényekkel (nagy mennyiség,
alacsony költség)
• célkitűzés:
– transzformációs technikák elsajátítása
– modellszervezet: dohány
– modellfehérje: PAF
Modell rendszerek
• Dohány (Nicotiana tabacum)
– transzfromációs rendszerek
– gyorsan növő, könnyen regenerálható
• PAF - Penicillium chrysogenum antifungális fehérje
– kis moltömegű, bázikus, ciszetinben gazdag
– rendellenes hifák, gátolt szaporodás
PAF
Pre
Pro
Lokalizáció
Összeszerelődés
Mature PAF
276 bp
96 aa
Transzfromálási technikák
• nukleáris transzformálás
– Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid
– T-DNS szakaszba transzgén
• kloroplaszt transzformálás
– homológ rekombináció
– magas expressziós színt
– nincs pollentranszmisszió
Vad típusú
plasztisz DNS
LTR
RTR
LTR
Szelekciós
marker
transzgén
RTR
LTR
Szelekciós
Transzformált marker
plasztisz DNS transzgén
RTR
Nukleáris transzformálás I.
• klónozó vektor szerkezete
– jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák
– kanamycin szelekciós marker
– PAF kazetta
LB
S35
Kanamycin
Tnos
szelekciós marker
P2
PAF kazetta
Tnos
RB
PAF
Nukleáris transzformálás II.
Pre-Pro-mature-PAF
Pre Pro
Mature PAF
P2’
Tnos
PAF
Pre-Pro-mature-PAF+ozmotin
Pre Pro
Mature PAF
P2’
GE+Pre-Pro-mature-PAF
Pre Pro
P2’
38P+Pre-Pro-mature-PAF
Mature PAF
GE
38P
mature-PAF
Tnos
PAF
Pre Pro
P2’
ozmotin Tnos
PAF
Mature PAF
Tnos
PAF
Mature PAF
P2’
PAF
38P+mature-PAF
Tnos
Mature PAF
P2’
38P
Tnos
Nukleáris transzformálás I.
• klónozó vektor szerkezete
– jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák
– kanamycin szelekciós marker
– PAF kazetta
• Agrobacterium tumefaciens transzformálása
• növények fertőzése
• regenerálás kanamycin tartalmú szelekciós
•
táptalajokon
regenerált növények vizsgálata DNS, RNS
szinten
LB
S35
Kanamycin
Tnos
szelekciós
marker
paf
pozitív
kontroll
P2
1 kb –os
standard
PAF kazetta
Tnos
negatív
kontroll
RB
Kloroplaszt transzformálás I.
• klónozó vektor szerkezete
– jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók
– aadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin
– promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia, transzgén
• transzformálás génpuskával
LTR
aadA szelekciós
kazetta
Prrn Pro Mature PAF trnC
RTR
Kloroplaszt transzformálás II.
transzformánsok szelektálása
spectinomycin tartalmú regenerációs táptalaj
spectinomycin
spectinomycin
streptomycin
Kloroplaszt transzformálás I.
• klónozó vektor szerkezete
– jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók
– aadA szelekciós kazetta - spectinomycin, streptomycin
– promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia
• transzformálás génpuskával
• regenerálás antibiotikum tartalmú táptalajokon
• transzgén beépülésének vizsgálata DNS szinten
1 kb-os
standard
1.
paf
LTR
pozitív
kontrollok
2.
aadA szelekciós
kazetta
Prrn Pro Mature PAF trnC
negatív
RTR
kontroll
Összefoglalás
•
•
•
•
több vektorkonstrukció tervezése
nukleáris transzformálás
kloroplaszt transzformálás
transzformánsok bizonyítása DNS, RNS szinten
• tervek:
– kloroplaszt transzformánsoknál a homoplazmikusság vizsgálata Sothern blot
technikával
– termelődött PAF fehérje kimutatása Western blot technikával
– PAF fehérje tulajdonságainak megjelenése a növényben gombafertőzés hatására
– más gazdaságilag fontos, illetve nem fehérje természetű anyag termeltetése
növényekkel
– további növényen kidolgozni a transzfromációs technikákat
A GM növények fogadtatása
Mérlegelni kell!
Zöld szervezetek (pl.: Greenpeace)
Multinacionális cégek
http://www.greenpeace.org/india/news/gm-indian-food-greenpeace-flags-the-good-the-bad
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Csak féligazságokat hallunk!
Veszélyes megenni?
„Nincs bizonyíték, hogy nem károsak.”
„...egy génkezelt krumplifajta kóros elváltozásokat
okoz az ezzel táplált patkányokon...”
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Csak féligazságokat hallunk!
Veszélyes megenni?
„2008-ban 25 országban ... 13,3 millió gazda foglalkozott genetikailag
módosított növények termesztésével.”
„Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés mellett nem fordult elő
olyan egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek jelentkezése
tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett volna a genetikailag
módosított növények termesztésével.”
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Tények!
Allegizálhat a transzgénről expresszálódott fehérje
A transzgén károsan befolyásolhatja a növény fiziológiai folyamatait
Antibiotikum rezisztenciát alakíthat ki
A transzgén önmaga veszélytelen, ha az általa kódolt fehérje nem jelenik
meg az élelmiszerben
A hatékony védelem rovarírtó- és gyomirtó szerek nélkül
Nagyobb terméshozam, egészségesebb, védettebb növény
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Konklúzió
Ne utasítsuk el tudatlanság vagy félelem miatt!
A hagyományos növénytermesztés, védelem gyakran károsabb
Lehetnek GM élelmiszerek, de több kritérium betartásával:
• A cégtulajdonosok vállaljanak felelősséget a termékeikért
• Tudjuk meg mit és hogyan módosítottak (legalább szakmai körökben)
• Amit megeszünk ne akkumuláljon gyomirtót, nehézfémet...
• Legyen vizsgálva az allergizáló hatása, és okoz-e toxicitást
• Legyen tényleg olcsó, hogy segítsen az éhínség problémáján
A GM növények ökológiai hatása
Jelentősebb az ökológiai kockázat
„A természeti környezetbe való kijutásával a génmódosított
élőlény beporzással, vagy a magok kihullása révén
ellenőrizhetetlenül kereszteződhet más, rokon fajtákkal, így
“elszennyezve” azok genetikai állományát.”
„A ma termesztett génmódosított növények 99%-a gyomirtószerekkel,
illetve kártevőkkel szembeni ellenálló-képességet hordoz, amely
tulajdonságok a fogyasztó számára semmilyen kézzelfogható előnnyel
nem járnak.”
A GM növények ökológiai hatása
Jelentősebb az ökológiai kockázat
„Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros elterjedés
mellett nem fordult elő olyan egészségügyi vagy
környezeti probléma, amelynek jelentkezése
tudományosan bizonyíthatóan összefüggésben lett
volna a genetikailag módosított növények
termesztésével. ”
„A spanyol és az ahhoz hasonló eredményt nyújtó francia és német
kísérletek alapján legfeljebb 20 m izolációs távolság szükséges a
genetikailag módosított és hagyományos kukorica tábla között, a 0,9
százalék feletti keveredés elkerüléséhez. A 0,9 % alatti véletlenszerű
keveredés a biotermékek esetében is megengedett az Európai Uniós
szabályozás alapján.”
A GM növények ökológiai hatása
Tények
Létezik a pollentranszmisszió
Olcsóbb az élelmiszerek előállítása
Felfigyeltek a kutatók is a kockázati tényezőkre
Gyakran GM növények végzik a környezeti károk felszámolását
(nehézfém mentesítés)
A GM növények ökológiai hatása
Konklúzió
Új módszerek fejlesztése feloldhatja az ökológiai kockázatot
(kloroplaszt trasnszformáns, szabályozott expresszió)
Ne termesszék egymás közelében a transzgént tartalmazó növényt
és az azzal rokon vad típusú növényt
Ha biztonságos és olcsó egyben, akkor alkalmas a
nagymennyiségű élelmiszer előállításra
Alternatíva a zárt rendszerű nagyüzemi termelés (bioreaktor,
nagyüzemi üvegház)
A GM növények gyógyszer- és ipari alapanyag
előállításra
Zárt rendszerben, megfelelő ipari technológiával hatékonyan
termelhető és kivonható a kívánt alapanyag
Alkalmas ipari alapanyag előállítására, kiváltva költségesebb,
környezetet károsító technológiákat
Nagymennyiségű, biztonságos vakkcinák előállítására, hormonok
és más drága enzimek előállítására használható
Előállíthatóak olyan fehérjék, melyek révén nem fehérje
természetű alapanyagok létrehozhatók
A GM növények szigorú szabályozása
EU komolyan veszi a kockázatokat, ezért biztonságos, de gyakran
nehézkes a GM növények termesztése, előállítása
EU színten szúrópróbaszerűen ellenőrizhetőek az egyes
laboratóriumok, cégek
Magyarországom a FVM foglalkozik a laboratóriumok
akkreditálásában
Komoly engedélyeztetési eljárás
Szigorú hulladékmegsemmisítés és szállítás
Elfogadjuk a GM növényeket?
?
http://www.eurekastreet.com.au/article.aspx?aeid=8150
http://www.wired.com/techbiz/people/magazine/15-07/st_kia
Nehéz kérdés, de vajon kell dönteni?
Gondolkozzunk józanul!