Transcript 活性氧的电化学分析新方法

同济大学博思论坛--环境与绿色化学
活性氧的电化学分析新方法
报告人：朱安伟
导 师：田阳 教授
同济大学化学系
1. 研究背景
活性氧物质 （Reactive Oxygen Species, ROS）
正常生理作用
应激（紫外线照射，
外界压力、贫血，食品
添加物，药物）
O2 •-、•OH、H2O2、1O2...
Hypoxanthine
Xanthine
老化
Fe3+, Cu2+
O2
e-
O2
·-
e-
H2O2
e-
·OH
e-
H2O
神经退行性疾病
CAT
ROS的代谢途径，及酶
参与代谢的过程
O2
·-
动脉硬化
catalase
SOD
O2
致癌
O2
炎症
ROS
反应活性高
存在时间短
局部浓度低
分析检测上的挑战
病理时水平变化宽
1. 研究背景
2. “Research Map”
研究体系
的确立
ROS的电化学检测
传感器的
材料选择
金属/半导体复合纳米
超疏水改性纳米金
等离子共振诱导光电流
非接触光催化系统
纳米多孔金
检测平台
的构建
层层自组装技术
检测技术
蛋白质直接电化学
电化学交流阻抗分析法
蛋白质直接电化学
耦合光电化学分析
VIS
3
3
b
2
a
1
TiO2
UV Light
e-
a
Au
ITO
TiO2
h+
H2O2
O2
I / μA
1
0
Diffusion
0
CH 3 CH 3 CH 3
Cyt. c (reduced) (II)
-1
(A)
e
-1
CH 3 CH 3 CH 3
-2
Cyt. c (oxidized) (III)
-3
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
E / V vs. Ag / AgCl
0.15
e
S
Cyt. c (oxidized) (III)
0.20
(B)
e
-3
-0.10
Cyt. c (reduced) (II)
S
S
-2
I TO
I / μA
b
2
-0.05
0.00
0.05
0.10
E / V vs. Ag / AgCl
0.15
0.20

S
CH 3 CH 3
·OH
CH 3 CH 3
S
e
e
S
S
e
ODT
S
S
S
Au
ITO
3. 细胞色素c在层层多孔纳米金膜修饰电极上的直接电化学
制备纳米多孔金电极
A / a. u.
12
6
5
8
b
300
A / a. u.
a
a
500 600
 / nm
700
800
I / μA
4
400
3
4
b
2
0
1
200nm
-4
200
300
400
500
600
λ / nm
700
800
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
E / V vs. Ag / AgCl
0.4
3. 细胞色素c在层层多孔纳米金膜修饰电极上的直接电化学
Cyt. c的修饰与表征
cyt. c的UV-vis，(a) 吸附在ZnO表面的cyt. c,
(b) 0.2 mmol / L cyt. c溶液
25 mmol / L PBS 中， (a)纳米多孔金电极 (b)
cyt.c修饰的纳米多孔金电极的循环伏安法，扫速
100 mV / s
3
411 nm
b
2
b
a
I / μA
A / a. u.
1
409 nm
0
-1
-2
a
-3
350
400
450
500
550
-0.10
λ / nm
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
E / V vs. Ag / AgCl
Soret band
/nm
Q-band
/nm
ZnO电极上的cyt. c
408
535
0.2 mmol/L cyt. c溶液
410
522
Cytochrome c 直接电子传递
electrode
Cyt. c(Fe(III))
e
Cyt. c(Fe(II))
H2O
H2O2
3. 细胞色素c在层层多孔纳米金膜修饰电极上的直接电化学
H2O2传感器的优化
0
10
60
40
20
Po
te
AA
2
UA
Na
NO
3
DA
不同电位下，模拟生理干扰物：
AA（抗坏血酸）, DA（多巴胺）
O2等的干扰。
-0.10
nt
ia
-0.05
O2
DO
PA
Na C
2 S
O
0
V
0
l/
Interference %
80
确定 -0.1 V (vs.
Ag|AgCl)为最优化的电
位
3. 细胞色素c在层层多孔纳米金膜修饰电极上的直接电化学
H2O2传感器性能评价
2
14
0
12
25 mmol / L PBS 中H2O2催
10
I / μA
-2
-4
8
化还原i-t图，工作电极：cyt.
6
4
-6
c/纳米多孔金 电极，外加电
I / μA
2
-8
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
C / mM
-10
-12
压-0.1 V (vs. Ag|AgCl)，插
图为H2O2浓度与稳态电流关
-14
系
-16
-18
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
T/s
Nanocomposites
Applied
potential
(mV)
Detection limit
(M)
Linear range (M)
Response
time (s)
Reference
Cyt. c/Nanoporous Au
-100a
6.3×10-6
1.0×10-5—1.2×10-2
8
c
Cyt. c/Au-NR
-100a
8.7×10-6
5.0×10-5—1.5×10-3
5
[84]
Cyt. c/Au/CP
-100a
1×10-5
1×10-5—1×10-3
—
[80]
Cyt. c/Au/Chit
-250b
9.8×10-6
8.5×10-4—1.3×10-2
8
[85]
HRP/Clay/Chit/Au
-300a
9×10-6
3.9×10-5—3.1×10-3
—
[86]
HRP/Au/TiO2
-600a
2×10-6
5×10-6—4×10-4
5
[87]
3. 细胞色素c在层层多孔纳米金膜修饰电极上的直接电化学
层层自组装技术
纳米多孔金
electrode
Cyt. c(Fe(III))
e
Cyt. c(Fe(II))
蛋白质直接电化学分析
H2O
H2O2
4.等离子共振诱导的金/二氧化钛纳米复合膜与细胞色素c的电化学耦合及分析信号放大
制备金/二氧化钛纳米复合电极及细胞色素c的修饰
(a)
(b)
500 nm
500 nm
0.5
0.3
0.2
0.4
A
(a)
0.1
(d)
0.3
0.0
A
350 400 450 500 550 600
λ / nm
0.2
0.1
0.0
350
400
450
500
λ / nm
550
600
修饰电极具有生物
兼容性、允许可见
光长时间光照。
4.等离子共振诱导的金/二氧化钛纳米复合膜与细胞色素c的电化学耦合及分析信号放大
等离子共振诱导的光电化学与细胞色素c的直接电化学耦合
3
b
2
a
0
空白cyt.c/TiO2/ITO
电极没有可见光激
发产生峰电流放大
现象！
-1
-2
-3
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
E / V vs. Ag / AgCl
20 nA
light off
20 s
a
light on
0.06
14
0.05
12
0.04
cyt. c的氧化还原态可以
调控光电流方向
10
0.03
8
0.02
6
b
light off
cyt. c的氧化还原峰电流增
大可能来源于等离子共振
诱导纳米金产生的光电流
0.01
4
0.00
450
500
550
600
λ / nm
650
700
ΔI / nA
c
cyt. c可以与Au/TiO2交换
电子产生放大的光电流。
A
I / μA
1
4.等离子共振诱导的金/二氧化钛纳米复合膜与细胞色素c的电化学耦合及分析信号放大
H2O2传感器性能评价
nanocomposites
nanocomposites
0
b
TiO2 NP on pyrolytic
Mb/Titanate Nanosheets
graphite
HRP/Au/TiO2–NTs
TiO2–NTs in potassium
fluoridesolution
PB/Au NPs
-2
-3
6
5
j / μA cm-2
j / μA cm-2
-1
-4
a
3
2
0
0
Hb/CMC–TiO2-NTs
Mb/nanoporous ZnO
a
b
20 40 60 80 100 120
C / μM
-6
0
-4
7.5×10-6 to 1.23×10
0.6 × 10–6
10-5
–6
2 × 10-3
to 3×10
1 × 10–4 to 6 × 10–3
4
1
-5
Linear
rangelimit
(M) (M)
Detection
300
600
900
1200
T/s
灵敏度提高4倍
1500
1800
Mb–TiO
MWNTs/core-shell
2-NTs
organosilica@chitosan
Sol-Gel Deposition of
AuNPs–C@SiO2
Titania Alternated with
Protein
HRP/CS/GPTMS
Plasmon-induced
Au/TiO
Plasmon-induced
Au/TiO
2 2
nanoneedles
nanoneedles
-5
4×10-6 to 6.4×10
2 × 10–6
-4
2×10-6 to 1.6×10
–7
2.5 × 10
-4
1×10-5 to 1.9×10
8 × 10–8
8.1× 10–8
-2
1×10-7 to 1.2×10
–8
4.5 × 10
4.等离子共振诱导的金/二氧化钛纳米复合膜与细胞色素c的电化学耦合及分析信号放大
金属/半导体纳米
复合材料
蛋白质直接电化学
耦合光电化学分析
等离子共振诱导
光电化学
5.电化学交流阻抗法检测巨噬细胞产生的∙OH(a)I
S
I
(a) T
T
O
O
非接触光催化系统中高选择灵敏检测羟基自由基
S
S
S
S
S
S
S S S
S S S
(b)
S
S S
S S
S
S
I
(a)
T
O
CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3
S
S
S
S
S
S
S
S
S
3
3
3
3
3
3
3
S
S
S
S
S
S
S
(b)
CH3
UV Light
S
-
ITO
TiO2
+
h
CH3CH3CH3
S
S
Diffusion
S
非接触氧化法的机理示意图
TiO2 nano particle
hv
O2
H2O2
L-cysteine
OH
H2O2
h O2 Diffusion
O2
CH 3 CH 3
·OH
CH 3 CH 3 CH 3
S
S
e
S

S
e
S
Photocatalyst
CH 3 CH 3
S
S
e
e
ODT
S
S
S
Au
ITO
S
Cytochrome c
+
CH 3 CH 3 CH 3
S
(d)
e-
S
S
S
S
S
S S
S
S
S
Substrate
S
S
S
S S S
S S
S
S
(d)
(d)
Cytochrome c
Cytochrome c
L-cysteine
L-cysteine
CH3CH3CH3
CH3 CH3CH3
S
S
+
S
(c)
H2O2
O2
CH3CH3CH3
gold nano particle
1-Octadecanethiol
e
3
OS
gold nano particle
gold nano particle
TiO2 nano particle
TiO2 nano particle
S
CH3
S
S
(c)
(c)
1-Octadecanethiol
1-Octadecanethiol
S
I
CH CH CH CH
TCH CH CH CH
O
S
S
(b)
CH3
CH3
S
S
S
S
(e)
S
S
+
5.电化学交流阻抗法检测巨噬细胞产生的∙OH
羟基自由基降解ODT
a
a
8
Intensity (a.u)
b
b
c
160
162
164
166
Binding Energy (eV)
c
-Zim / KΩ
S 2p
6
4
b
2
0
a c
0
2
4
6
Zre / KΩ
8
不同界面的S 2p轨道XPS谱图 不同基底的静滴接触角照片 不同电极表面的Nyquist
图
( a) 花状纳米金电极，( b) ODT/Au电极，( c) 经紫外灯照射ODT完全被除去后的ODT/Au电
极
5.电化学交流阻抗法检测巨噬细胞产生的∙OH
EIS检测TiO2非接触光催化过程中的∙OH
10000
100
Rct decrease / %
80
-Zim / Ω
8000
6000
ITO
60
40
1 cm
20
1 cm
0
-20
0
80
4000
160
240
320
400
Humidity-controlled air
50 µm
T / min
Cold mirror filter
2000
0
TiO2
h g f
0
e
c
d
2000
4000
b
UV light
a
6000
8000 10000
Zre / Ω
ODT/Au电极经紫外光照射不同时间后的交流阻抗Nyquist图。
插图：ODT/Au的Rct减小百分比与紫外光照时间
的线性关系图。
结
ITO
Collecting solution
收集TiO2非接触光催化体系中H2O2装置示意图（无光掩模）
论
实验测得H2O2的线性检测范围是0.9 ~ 21.9 nmol，最低检测限为
0.9 nmol。根据双激发原理，HO˙的最低检测限约为1.8 nmol。
5.电化学交流阻抗法检测巨噬细胞产生的∙OH
其它活性氧的影响
（a）H2O2，（b）O2−，（c）1O2，（d）ONOO−，（e）
ROO˙和（f）HO˙对ODT/Au电极Rct的影响
（a）H2O2，（b）O2−，（c）1O2，（d）ONOO−，（e）
ROO˙和（f）HO˙对ODT/Au电极表面静滴接触角的影响
ODT自组装膜对HO˙具有很高的
选择性，适用于复杂环境中˙OH的
选择性检测
5.电化学交流阻抗法检测巨噬细胞产生的∙OH
脂多糖刺激小鼠单核巨噬细
胞产生的羟基自由基
Step 1:
LPS
HO˙ attack
ITO
Cell ODT Au/ITO
Step 2: EIS experiment
8000
C.E. W.E. R.E.
310 K
5 ml
Hanks’ solution
hexacyanoferrate
-Zim /Ω
˙OH
6000
4000
stirrer
a
thermostat
Pt ODT Au/ITO Ag/AgCl
EIS技术检测脂多糖刺激小鼠单核巨噬细胞产生的HO˙的实验过程图
讨
2000
b
0
0
论
空白实验表明未受LPS刺激的
RAW246.7细胞或单独使用LPS没有细胞存
在时均不会对电极表面ODT分子产生破坏作
用
2000
4000
6000
8000
Zre /Ω
（a）ODT/Au电极，（b）ODT/Au电极受脂多糖
刺激小鼠单核巨噬细胞产生的HO˙攻击后的交流
阻抗Nyquist图
5.电化学交流阻抗法检测巨噬细胞产生的∙OH
超疏水自组装单分子层膜修饰纳米金
非接触光催化系统
UV Light
e
-
ITO
TiO2
+
h
H2O2
O2
Diffusion
CH 3 CH 3 CH 3
CH 3 CH 3
·OH
CH 3 CH 3 CH 3
电化学交流阻抗
分析法
S
S
e
S

S
CH 3 CH 3
S
e
S
S
e
e
ODT
S
S
S
Au
ITO
结果与讨论
基于纳米多孔金膜的H2O2传感器
采用层层自组装技术首次在ITO电极表面制备出
纳米多孔金膜，并且提高了cyt.c的电子传递速率
保持了cyt.的生物催化活性，构建了H2O2传感器
 等离子共振诱导的光电化学法检测H2O2
首次将等离子共振诱导下金/二氧化钛纳米复合
体系产生的光电流应用于电化学传感器，产生
了放大的光电流，提高了cyt.c的循环伏安响应
电流，显著提高了检测H2O2的性能。
 基于ODT/Au电极的电化学交流阻抗法检测 ∙OH
首次用EIS技术灵敏表征TiO2非接触光催化过程
中铁氰化钾在修饰电极表面的Rct的变化，显著
提高了∙OH的分析特性，并将此方法成功应用于
免疫细胞应激产生的∙OH的测定
致谢
国家自然科学基金
教育部新世纪优秀人才计划
上海市纳米科学基金
同济大学