Transcript 초음파 추출 후 고분자 한외여과막을 통해 여과하는 방법

모발 성장 촉진제
10-2009-0039413 [특허출원]
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본 발명은 탈모 방지 및 모발 성장 촉진제 조성물에 관한 것으로, 특히
목향, 구기자, 하고초 및 지부자로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선
택되는 한약재를 초음파로 추출한 후 10,000 내지 200,000 달톤
(dalton) 정도의 분획분자량(molecular weight cut-off) 을 갖는 고분
자 한외여과막(ultrafiltration membrane)을 사용하여 추출물 내 존재
하는 전분, 고무질, 회분, 단백질 및 당분 등 불순물을 제거하여 탈모
방지 및 모발 성장 촉진 효과가 우수한 조성물에 관한 것이다.
10-2009-0039413 [특허출원]
열수추출
실온추출
가온추출
고분자 한외여과막을 통해
불순물을 여과 및 제거하는
경우, 탈모 억제 및 모발 성장
촉진효과가 매우 향상!
초음파추출
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탈모의 원인
•
•
•
•
•
•
•
남성호르몬 작용 과잉설
피지분비 과잉설
혈액순환 불량설
과산화물이나 세균 등에 의한 두피기
능 저하설
유전적 요인
노화
스트레스 등
그러나 현재까지 탈모에
관한 명백한 원인은
밝혀지지 않은 상태!
5α-리덕타제
테스토스테론
디하이드로테스토스테론
일정한 수용체와 결합
탈모 유발 단백질 유도
남성형 탈모증은 5α-리덕타제의 작용에 의한 디하이드로테스토스테론의 과잉생성 때문
5α-리덕타제 활성을 억제한다면 남성형 탈모증을 근본적으로 예방 및 치료 가능!
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재료
• 목향(Saussurea lappa)
–국화과에 속한 다년생 초본인
목향의 뿌리를 건조한 것
–행기지통(行氣止痛), 온중화
위(溫中和胃)
–혈관확장, 혈압강하 및 소염
• 구기자(Lycium chinense)
–가지과에 속한 구기자 나무
또는 기타 동속식물의 열매를
건조한 것
–자신보양명목(慈腎補陽明目),
윤폐지해(潤肺止咳)
–면역조절, 조혈기능촉진, 항
노화 등
출처 : encyber.com
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• 하고초(Prunella vulgaris
var.lilacina)
– 다년생 초본인 꿀풀의 꽃이삭
을 건조한 것
– 청간화(淸肝火), 청열산결(淸熱
散結)
– 혈압강하, 소염, 면역억제 및
향균
출처 : encyber.com
• 지부자(Kochia scoparia)
– 명아주과에 속한 1년생 초목
인 댑싸리의 과실
– 청열이수(淸熱利水), 이습지
양(利濕止痒)
– 피부소양증
출처 : herb.daegu.go.kr/
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실시예
•동물실험 모델
– 생후 42~56일 된 마우스(C57BL/6, 수컷) 모
델
– 체모는 검정색, 자발적 탈모(spontaneous
alopecia)
– 멜라노사이트(melanocyte)가 모낭에만 한정적
으로 존재
– 멜라닌 함성이 모발 성장 주기와 일치
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실시예
• 비교예 1. 열수 수출 방법
• 비교예 2. 초음파 추출 방법
– 목향, 구기자, 하고초 및 지부자를 건조하여 세절한 후 추출물은
동량으로 혼합
– 추출용매(증류수 : 1,3-부틸렌글리콜 = 7:3)를 400ml첨가
– 약탕기(DWP-5000, 대웅약탕기)
에서 끓이면서 4시간동안 추출
– 침전물이 생기지 않도록 0.2㎛
필터로 여과하여 최종 추출물을
얻음.
– 실온에서 초음파추출기(SM30CE, 소니메디)로 4시간동안 추
출
– 침전물이 생기지 않도록 0.2㎛
필터로 여과하여 최종추출물을
얻음.
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실시예
• 실시예 1. 초음파 추출 후 고분자 한외여과막을 통해 여과
하는 방법
– 목향, 구기자, 하고초 및 지부자를 건조하여 세절한 후 추출물은
동량으로 혼합
– 추출용매(증류수 : 1,3-부틸렌글리콜 = 7:3)를 400ml첨가
– 실온에서 초음파추출기(SM30-CE, 소니메디)로 4시간 동안 추
출
– 캐트리지형 전처리 여과기 통과 시킨 후 한외여과막으로 여과하
여 최종추출물 얻음.
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실시예
• 실험예 1. 모발성장기 유도 촉진 작용 평가
– 상기 실시예 1,2,3에서 제조한 한약재 추출물의 모발성장 촉진 효과를 알아보기 위해 모발성장
기 유도 작용 실험 실시
– 마우스 등 부위 털 제거, 하루동안 적응기간
– 제모부위에 대조약 및 한약재 추출물 도포
– 대조약 : 40% 에탄올, 시험약 : 실시예 1,2,3에서 제조한 각 한약재 추출물 사용
– 마우스 개체당 등 부위에 1일 1회 100uL씩 28일간 도포
– 결과를 화상분석기를 이용해 털을 제거한 면적에 대해 신생모가 자란 면적의 비율을 구하고 그
평균값으로 평가
– 한약재 추출물의 모발 성장기 유도 촉진작용 평과 결과
면적비(%)
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
열수추출
초음파추출
초음파+한외여과
막
0
0.01 0.1
1
10
농도(%)
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• 실험예 2. 모낭세포 활성 증가
– 상기 실시예 1,2,3 에서 제조한 한약재 추출물의 모낭 세포 활성 효능을 측정하기 위해, 두피조직
으로 부터 모낭조직 분리
– 두피조직을 70% 에탄올에 1분간 침척하여 멸균시키고 세포배양용 배지인 DMEM으로 3회 세척
함
– 표피를 분리시키고 진피에 박혀있는 모낭을 핀셋을 이용해 1개씩 뽑음
– 분리된 모낭을 10% FBS이 함유되어있는 DMEM배양액으로 옮기고 모유두가 들어있는 모낭의 아
래부분을 메스로 절단
– 분리한 모유두를 20% FBS가 함유된 DMEM배양액으로 옮겨 2주간 배양
– 모유두 조직으로부터 세포가 자라나기 시작하면서 배양용기에 가득 차면 0.25% 트립신, 0.02%
EDTA로 세포를 배양용기에서 분리한 후 계대 배양하여 세포를 계속 배양
– 2~3 계대의 모유두 세포를 10% FBS가 들어있는 DMEM 배양액으로 2 X 104/mL 농도로 희석한
후 이를 60 mm 배양용기에 5mL씩 넣어주고 37℃ 배양기에서 24시간 배양
– FBS가 함유된 배양액을 제거하고 FBS가 들어있지 않은 배양액 및 한약재 추출물이 함유된 배양
액으로 교환하여 24시간 배양한 후, 방사선으로 표지된 타이미딘(Thymidine)을 배양접시당
10uCi씩 첨가해주고 24시간을 더 배양
– 배양이 끝난 세포를 인산 완충용액으로 3회 씻어주고 5% 트리클로로아세트산(trichloroacetic
acid)으로 1회 세척
– 세포를 0.1% 소디움도데실설페이트, 0.5N 수산화나트륨 용액으로 녹인 후 신틸레이션 칵테일
(scintillation cocktail)에 섞어주고 방사선 동위원소의 양을 베타-카운터(ß-counter)를 이용해 측
정
– 세포활성도는 대조군에 대해 방사능 표지된 타이미딘을 세포 내로 어느 정도 많이 업테이크
(uptake)하였는지로 비교 평가
10
160
140
세
포 120
증
식 100
활
성 80
능
60
(%)
열수추출
초음파추출
초음파+한외여과막
40
20
0
0.000001
0.00001
0.0001
농도(%)
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• 실험예 3. 세포독성평가
– 상기 실험예 1,2,3의 한약재 추출물에 대해
V79-4세포(차이니스 햄스터, 폐조직 섬유아
세포의 연속 세포주)를 배양하여 MTT시험을
하는 방법(Mossman T. J. Immunol. Meth.
55-63(1983))을 수행하여 세포 독성을 시험.
대조군으로 SLS를 사용
시료
IC50 (%, w/v)
SLS
0.005
비교예 1
1.00
비교예 2
5.00
실시예 1
10.00
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• 실험예 4. 알러지평가
– 상기 실시예에서 제조한 초음파 추출 후 고분자 한외여과막으로
여과한 한약재 추출물의 알러지 유발 여부를 확인하기 위하여 운
반 매개물로 에탄올을 사용하는 실험법을 택함
→[참고문헌 : Kimber Ⅰ(1990) : Identification of contact allergens
using the murine local lymph node assay, J. Appl. Toxicol.
10(3); 173-180].
– 상기 실시예에서 있듯이 초음파 추출 후 고분자 한외여과막으로
여과한 한약재 추출물을 20.0 중량%, 40.00 중량% 및 60.00 중
량% 용액으로 제조 후 시행. 즉 생쥐(Balb/c)의 양쪽 귀에 50
㎕씩 3 일간 발라준 후 쥐로부터 이개임파절(auricular lymph
node)을 분리
– 임파절을 분쇄하여 단일세포 상태로 만든 후 방사성 동위원소인
[3H]-메틸티미딘([3H]-methyl thymidine)을 첨가하여 24 시간
배양한 다음, β-신틸레이션 계수기(Beckman LS 6000 TA,
USA)를 이용하여 세포의 증폭도(dpm, disintegrations per
minute)를 측정. 대조군으로는 에탄올 60 %용액을 사용.
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시료
임파절세포 수
(107세포/mL)
Cmp
(평균)
증폭도
에탄올
2.13
2481
운반매개물
초음파 추출 후 한외여과막으로
여과한 한약재 추출물
1.87
1530
0.6
초음파 추출 후 한외여과막으로
여과한 한약재 추출물
1.88
2337
0.9
초음파 추출 후 한외여과막으로
여과한 한약재 추출물
1.87
2336
0.9
• 발명의 효과
– 본 발명에 따르는 초음파 추출 후 고분자 한외여과막
으로 여과한 모발 성장 촉진 조성물은 기존의 열수 추
출이나 초음파 추출보다 모발이 성장기 유도 촉진 작
용과 모낭세포 활성이 훨씬 뛰어남.
– 또한 피부독성이 적고 피부 트러블 유발이 없어 우수
하여 매우 안전함.
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