ΚΑΛΗ Γ. ΜΑΚΕΔΟΥ

Ιατρός Βιοπαθολόγος Διδάκτορας Α.Π.Θ.

Επιστημονική Συνεργάτης Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ.

ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ

 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ - ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ  ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ  ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ – ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑ

ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ

 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ - ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ  ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ  ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ – ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑ

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ

 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ  ΦΛΟΓΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ

 Αρχές:  Το φως αναλύεται όταν διαπερνά ένα γυάλινο πρίσμα.

 Όλες οι ενώσεις στη φύση απορροφούν ακτινοβολίες

ΗΛΕΚΤΡΟΜΑΓΝΗΤΙΚΟ ΦΑΣΜΑ Τμήμα Ακτινοβολίας

Μήκος Κύματος

Ακτίνες Χ Υπεριώδες Ορατό Εγγύς Υπέρυθρο Υπέρυθρο Άπω Υπέρυθρο Μικροκύματα Ραδιοσυχνότητες

0,3 – 100 Α 200 – 380 nm 380 – 750 nm 0,75 – 2,5 μm 2,5 – 15 μm 15 – 200 μm 0,2 – 7,0 mm 100 – 10000 m

*

Φάσμα απορρόφησης

το μήκος κύματος : Η απεικόνιση της απορρόφησης ή της διαπερατότητας της ακτινοβολίας σε συνάρτηση με *

λmax

: Το μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης, χαρακτηριστικό για κάθε ένωση

ΦΩΤΟΜΕΤΡΟ



Πηγή φωτός

: βολφραμίου (ορατό), Hg ή H 2 (υπεριώδες) 

Μονοχρωμάτορας

: Φίλτρα: φωτόμετρα χρωματιστά γυαλιά – απλά Πρίσματα : κάμπτεται φως με μικρό μήκος κύματος περισσότερο από μεγαλύτερο - φασματοφωτόμετρα εκείνο με  

Κυψελίδες

:

Ανιχνευτής

: Γυάλινες (ορατό), χαλαζία (υπεριώδες) φωτοκύτταρο ή φωτοπολλαπλασιαστής

ΑΠΟΡΡΟΦΗΤΙΚΟΤΗΤΑ ή ΑΠΟΣΒΕΣΗ

Νόμος Lambert-Beer: log Io / I = k ∙ C ∙ l



log Io / I

=

A ή OD ή Ε

A = k ∙ C ∙ l 

k

:

συντελεστής μοριακής απορροφητικότητας

1cm και C = 1M και λ=λmax αν l =    ε ή Α Μ ή Ε Μ / ε mM / E 1% ή Α 1% Μονάδες : Μ -1 cm -1 Εξαρτάται από φύση ένωσης, μήκος κύματος, διαλύτη, pH

Νόμος Lambert – Beer : Α = k ∙ C ∙ l

ω y = ax εφω = k = Α / C Συγκέντρωση (C)

ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑ



T = I / Io.

Άρα

Α = - log T



Εκφράζεται σε % (Τ=0%, Α=∞ και Τ=100%, Α=0) ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ ΙΣΧΥΟΣ ΤΟΥ ΝΟΜΟΥ LAMBERT-BEER

 Τα διαλύματα δεν είναι πυκνά (0,1 < Α < 1)  Η ακτινοβολία είναι μονοχρωματική  Η κυψελίδα έχει ομοιόμορφη διατομή  Τα μόρια δεν αντιδρούν μεταξύ τους  Η μέτρηση γίνεται στο λmax (μέγιστη ευαισθησία)

ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΦΩΤΟΜΕΤΡΟΥ

 ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟΥΣ ΣΚΟΠΟΥΣ: Συνεχές φάσμα, μεγάλη ακρίβεια, επαναληψιμότητα  ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΡΟΥΤΙΝΑΣ: ταχύτητα, επαναληψιμότητα, αυτοματοποίηση με φίλτρα, κυψελίδα θερμοστατούμενη, χρονόμετρο, μνήμη και καταγραφικό  ΕΥΚΟΛΙΑ ΣΤΗ ΧΡΗΣΗ  ΟΓΚΟΣ, ΣΧΗΜΑ, ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ

ΦΩΤΟΜΕΤΡΗΣΗ

 Το διάλυμα πρέπει να είναι σε ισορροπία  Μηδενισμός με το ΤΥΦΛΟ (blank) , που περιέχει όλα τα αντιδραστήρια και έχει υποστεί τη διαδικασία που έχει υποστεί και το δείγμα, δεν περιέχει όμως

την ένωση που θέλουμε να προσδιορίσουμε.



Κυψελίδα καθαρή

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ



Ποιοτικός προσδιορισμός ( ταυτοποίηση, ανίχνευση )

 280nm: ανίχνευση πρωτεϊνών σε απομονωμένο DNA 

Ποσοτικός προσδιορισμός

 

Με πρότυπο διάλυμα Με κατασκευή πρότυπης καμπύλης

Α5 Α4 Α3 Αχ

ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΠΡΟΤΥΠΗ ΚΑΜΠΥΛΗ

Α2 Α1 Cx C1 C2 C3 Συγκέντρωση (C) C4 C5

ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΠΡΟΤΥΠΟ ΔΙΑΛΥΜΑ

 Α χ = k C x l  Α π = k C π l  Άρα Α χ / C x = Α π / C π C x = ( C π / Α π ) Α χ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ (ΙΙ)

 Μελέτη της κινητικής των ενζύμων και υπολογισμός της ενεργότητας του ενζύμου (ταχύτητας της αντίδρασης) V 0 = dA/dt = = dC/dt  Μονάδες v 0 : moles/l.min

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ (ΙΙΙ)

 Μελέτη κινητικής αντιδράσεων, π.χ. της οξείδωσης των LDL Λιπαρό οξύ LH Ρίζα λιπαρού οξέος L .

L .

Συζευγμένα διένια Υπεροξειδική ρίζα LOΟ .

Υπεροξείδιο LOOH H .

HΟΟ ΟO H O 2 H .

COOH Αφαίρεση υδρογόνου COOH Αναδιοργάνωση των διπλών δεσμών COOH Πρόσληψη οξυγόνου COOH Αφαίρεση υδρογόνου από άλλο λιπαρό οξύ COOH

1,0 Τυπική καμπύλη οξείδωσης των LDL με Cu 2+ Έναρξη Διάδοση Τερματισμός 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 30 Χρόνος καθυστέρησης (lag time) 60 90 120 Χρόνος (min) 150 180

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ



Άμεση παρακολούθηση μεταβολής συγκέντρωσης έγχρωμων ουσιών



Έμμεση φωτομετρία άχρωμων ενώσεων (με τη βοήθεια χρωμογόνου) ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΕΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ



Προσδιορισμός αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT) ή γλουταμική πυρουβική τρανσφεράση (GPT) - 340nm

L-αλανίνη + α-κετογλουταρικό LDH Πυρουβικό + NADH + H + GPT L—γλουταμικό + πυρουβικό γαλακτικό + NAD +

ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ

 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ  ΦΛΟΓΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ (ΦΑΑ)

Ανάλυση χημικών στοιχείων - αλκαλικών μετάλλων (ιχνοστοιχείων), π.χ.

Zn σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις.

Προσδιορισμός συγκέντρωσης (σε διάλυμα) ή περιεκτικότητας (στερεό δείγμα)  Καθοδική λυχνία με αργό ή νέο: του στοιχείου που πρόκειται να ανιχνευθεί  Καυστήρας: Φλόγας ή χωρίς φλόγα (καυστήρας γραφίτη)  Μονοχρωμάτορας  Ανιχνευτής

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ (ΦΑΑ)

 Η φλόγα / φούρνος γραφίτη δίνει θερμική ενέργεια στο δείγμα (μετά από εξαέρωση)  Διασπώνται οι χημικοί δεσμοί του μετάλλου (ατομοποίηση)  Βρίσκεται σε σταθερή μη διεγερμένη ενεργειακή κατάσταση  Τα άτομα του στοιχείου απορροφούν ακτινοβολία από καθοδική λυχνία στοιχείου ίδιου με το υπό εξέταση  Α = σταθερή C = εxC , όπου χ=μήκος καυστήρα

ΦΛΟΓΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ

 Προσδιορισμός Κ, Να, Ca, Li, Mg  Μέρη : Νεφελωτής, καυστήρας, οπτικό σύστημα, ανιχνευτή  Διαφορές από ΦΑΑ  Τα άτομα των στοιχείων είναι διεγερμένα (εκπέμπουν)  Φλόγα χαμηλής θερμοκρασίας, η οποία αντικαθιστά τη φωτεινή πηγή  Φίλτρα για μονοχρωμάτορες  Χαμηλού κόστους

ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ

 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ - ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ  ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ  ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ – ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑ

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ (ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ)

 Φωταύγεια: Εκπομπή φωτός ή ακτινοβολίας όταν ένα ηλεκτρόνιο επιστρέφει από ένα υψηλό επίπεδο ενέργειας σε χαμηλότερο επίπεδο ενέργειας  Φθορισμό, αποδιέγερση <10 -5 sec  Φωσφορισμό, αποδιέγερση σε >10 -5 sec  Χημειοφωταύγεια  Βιοφωταύγεια  Διέγερση με υπεριώδες, εκπομπή ορατού φωτός  Ένταση του φθορισμού ανάλογη της ποσότητας της ουσίας

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΟ

F = φ Ι 0 (2.203 abc)

F: σχετική ένταση φθορισμού, φ: αποτελεσματικότητα φθορισμού, Ι 0 : αρχική ένταση της διέγερσης, α: μοριακός συντελεστής απορροφητικότητας, b: ο όγκος του χώρου από όπου περνάει το φως διέγερσης και εκπομπής, c : συγέντρωση της μετρούμενης ουσίας σε mol/l Πηγή : τόξο ξένου, λυχνίες χαλαζία αλογόνου και υδρογόνου

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑΣ

 Μέτρηση ορμονών (Αναλυτές Magic Lite) – Σήμερα με χημειοφωταύγεια  Προσδιορισμός επιπέδων φαρμάκων (Αναλυτής TDX Abbott – ανοσομέθοδο φθορισμού πρόσθιας πόλωσης FPIA)  Ευαισθησία μικρότερη χημειοφωταύγεια και βιοφωταύγεια από

ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

 Προκαλείται διέγερση των ατόμων ύστερα από χημική αντίδραση.

 Οξείδωση οργανικής ουσίας, π.χ.

λουμινάλης από οξειδωτική ουσία, π.χ. υπεροξείδιο υδρογόνου  Εκπομπή φωτός από το διεγερμένο προϊόν της χημικής αντίδρασης  Βιοφωταύγεια : φωταύγειας με ενίσχυση καταλυτική της αντίδρασης πρωτεΐνη, λουσιφεράση. Μεγαλύτερη ευαισθησία.

π.χ.

ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ

 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ - ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ  ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ  ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ – ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑ

ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ

 Προσδιορισμοί που στηρίζονται στην αντίδραση αντιγόνου (Ag) – αντισώματος (Ab) , ισχυρή αλλά αναστρέψιμη  Χρήση Ag ή Ab σημασμένου με «ανιχνευτές»:  Ένζυμα , horseradish peroxidase, αλκαλική φωσφατάση, β-γαλακτοσιδάση, ουρεάση  Ραδιοϊσότοπα  Φθορίζουσες χρωστικές   Μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα Προσδιορίζονται ουσίες μικρού μοριακού βάρους Ορμόνες, φάρμακα (αντιγόνο) και αντισώματα , π.χ.

ΒΗΜΑΤΑ ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

 Τοποθέτηση υποστρώματος στην πλάκα  Προσθήκη δείγματος  Προσθήκη ανιχνευτή σημασμένου  Προσθήκη χρωμογόνου (ΕΙΑ, ΕLISA)  Ανίχνευση ακτινοβολίας

ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΡΧΙΚΗΣ ΦΑΣΗΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΤΕΛΙΚΟΥ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΥΜΠΛΕΓΜΑΤΟΣ

Α. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΡΧΙΚΗΣ ΦΑΣΗΣ

 Ανταγωνιστικές μέθοδοι αποτέλεσμα αντιστρόφως ανάλογο της C  (χρήση σημασμένου Ag) – Ραδιοανοσοχημικές (RIA)  Ενζυμοανοσοχημικές (EIA)  Ανοσοχημειοφωταύγεια (CHIA)  Ανοσοφθορισμομετρικές (FIA)  Ανοσομετρικές μέθοδοι αποτέλεσμα ανάλογο της C (χρήση σημασμένου Ab) –  Ανοσοραδιομετρικές (IRMA)  Ανοσοενζυμομετρικές (ELISA)  Ανοσοφωταυγειομετρικές (ICHMA)

   IRMA ELISA ICHMA     RIA EIA CHIA FIA

Κ. Μακέδου - Αρχές Μεθόδων Βιοχημικών Προσδιορισμών

ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ

 Οι ανοσομετρικές μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα από τις ανταγωνιστικές  RIA και IRMA vs EIA και ELISA :  Μεγάλη τοξικότητα – Αθροιστικοί κίνδυνοι  Διαφορές στην τοξικότητα ραδιοσημασμένων προϊόντων από εταιρεία σε εταιρεία  Μικρή σταθερότητα αντιδραστηρίων  Ακριβά και εξειδικευμένα όργανα

ΤΕΧΝΙΚΕΣ

ELISA

(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

 Ομοιογενείς τεχνικές ELISA :  Γίνονται σε ένα χρόνο  Ανίχνευση φαρμάκων, π.χ. διγοξίνη, γενταμυκίνη (

ΜΙΚΡΩΝ

μορίων)  Ετερογενείς τεχνικές ELISΑ  Απαιτείται διαχωρισμός αντιδρώντων – μη αντιδρώντων (πλυσίματα), ΛΙΓΟΤΕΡΟ ΤΑΧΕΙΕΣ  Ανίχνευση Ag ή Ab και πρωτεϊνών ορού σε λοιμώδη νοσήματα (

ΜΙΚΡΑ & ΜΕΓΑΛΑ

μόρια).

ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ

 Ανταγωνιστική ELISA  Συνδεδεμένα με Ε Abs ανταγωνίζονται τα Abs του δείγματος  Δεν διαχωρίζει τάξεις ανοσοσφαιρινών  Έμμεση ELISA  Δεσμευτική (capture) ELISA

ΕΜΜΕΣΗ (SANDWICH) ELISA

   Ag + Ab ορού + αντιανθρώπειος σφαιρίνη συνδεδεμένης με Ε γ Ορολογική διάγνωση λοιμωδών νοσημάτων

Διαχωρίζει τάξεις

 

ανοσοσφαιρινών

Ψευδώς αποτελέσματα για IgM και IgA αρνητικά, λόγω ανταγωνισμού από ΙgG Ψευδώς θετικά, λόγω ρευματοειδούς παράγοντα

ΔΕΣΜΕΥΤΙΚΗ (CAPTURE) ELISA ΓΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ

 Ανίχνευση μιας τάξης (Μ ή Α) ανοσοσφαιρινών

ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ

 Ανταγωνιστική ELISA  Ανίχνευση αφυλατοξίνης στον ορό  Dot-spot ELISA  Τοποθέτηση κηλίδας δείγματος πάνω σε ταινία νιτροκυτταρίνης   Προσθήκη συνδεδεμένου συνδεδεμένου με αντι-Ab με Ε με Ε Ab ή Ανίχνευση αντισωμάτων σε μικρές ποσότητες, π.χ. έναντι του Τρεπονήματος του ωχρού μη  Δεσμευτική (Capture) ELISA  Χλαμύδιο του τραχώματος και Giardia Lamblia στα κόπρανα

ΔΕΣΜΕΥΤΙΚΗ (CAPTURE) ELISA ΓΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ (διπλού Sandwich)

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ

 Μικροβιολογία  Ιολογία  Σεξουαλικώς μεταδιδόμενα νοσήματα  Μυκητολογία  Παρασιτολογία  Αυτοάνοσα νοσήματα  Καρκίνος  Ορμόνες  Αλλεργίες  Αιματολογία

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ

 Ανίχνευση αντιδιφθεριτικής τοξίνης  Βρουκέλλες  Λεγεωνέλλες  Campylobacter jejuni * IgG, IgM * Εντεροτοξίνη  Δονάκιο της χολέρας

ΙΟΛΟΓΙΑ

 Απλού Έρπητα  Ανεμευλογιάς  CMV  Epstein Barr  Γρίππης   Ερυθράς, Ιλαράς, Παρωτίτιδας Παραϊνφλουέντζας  Εντεροϊούς  Αδενοϊούς  Rota  Ηπατίτιδας

ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΩΣ ΜΕΤΑΔΙΔΟΜΕΝΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

  Ναϊσσέρια γονορροϊκή Ιό Απλού Έρπητα  Χλαμύδιο τραχώματος (δεσμευτική Ag ELISA)  AIDS (screening)

ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ

Επικουρικά στις εν τω βάθει μυκητιάσεις από    Ασπέργιλλο Κρυπτόκοκκο Candida

ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΙΣ

 IgG: Έμμεση ELISA  IgM: Δεσμευτική αντισώματος ELISA

ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

 Αντιπυρηνικά (Αντι-DNA) Ab  Αντι-κυτταροπλασματικά  ANCA  Έναντι Ag θυρεοειδούς  Αντιφωσφολιπιδικά  Αντικαρδιολοπινικά

ΜΕΤΡΗΣΗ ΟΡΜΟΝΩΝ Sandwich ELISA

 Γοναδοτροπίνες     Στεροειδείς ορμόνες Κορτιζόλη Θυρεοειδοτρόπος (TSH) T3, T4, Ινσουλίνη

ΝΕΟΠΛΑΣΜΑTA

 Ανίχνευση Ags καρκίνου πνεύμονα με μονοκλωνικά Ab

ΑΛΛΕΡΓΙΕΣ

 Ολική IgE  Ειδική IgE  Ισταμίνη

ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑ

 Παράγοντες πήξης  Ιστικός ενεργοποιητής πλασμινογόνου  Αναστολέας ενεργοποιητή πλασμινογόνου

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ELISA

 Πιο ευαίσθητη  Μπορεί να αυτοματοποιηθεί  Δεν απαιτεί τόσο εξειδικευμένο προσωπικό  Δίνει αντικειμενικά αποτελέσματα  Δίνει ποσοτικές και όχι ημιποσοτικές μετρήσεις  Μπορούν να ανιχνευτούν και τάξεις των ανοσοσφαιρινών  Ευελιξία  Προσδιορισμό ουσιών από μίγματα (με δεσμευτική ELISA)

ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

Α. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΡΧΙΚΗΣ ΦΑΣΗΣ Β. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΤΕΛΙΚΟΥ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΥΜΠΛΕΓΜΑΤΟΣ

ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΤΕΛΙΚΟΥ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΥΜΠΛΕΓΜΑΤΟΣ

ΠΟΙΟΤΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ Διπλή ανοσοδιάχυση Μονή ανοσοδιάχυση Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση Ηλετροανοσ ομέτρηση

ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ

ΔΙΠΛΗ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ

ΚΥΚΛΟΤΕΡΗΣ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ

ΕΦΑΡΜΟΓΗ : Ποσοτικός προσδιορισμός 1. βακτηριδιακών Ag 2. IgG, M, A πολύ μικρές ποσότητες

ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ

 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ - ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ  ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ  ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ – ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ Μελέτη της επίδρασης της θολερότητας (παρουσίας αιωρούμενων) στη μετάδοση και τη σκέδαση του φωτός  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑ

ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ

 Μέτρηση της ελάττωσης της έντασης του φωτός που διέρχεται μέσα από εναιώρημα, λόγω σκεδασμού , υπό γωνία 180 ο , σε φασματοφωτόμετρο.

 Μέθοδος εκλογής για δείγματα με έντονη θολερότητα, που τα αιωρούμενα σωματίδια έχουν κύτταρα, ανοσοσυμπλέγματα, κλπ.

μεγάλο μέγεθος σε σχέση με το μήκος κύματος του ορατού φωτός, π.χ.

ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ



Μέτρηση του ποσού του φωτός που σκεδάζεται

 γωνία προς το προσπίπτον φως, όταν αυτό διέρχεται μέσα από εναιώρημα.

Μήκος κύματος διεγειρόμενου = μ.κ ανιχνευόμενου υπό

ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ

 Μέθοδος εκλογής για δείγματα, σχετικά διαυγή, στα οποία αιωρούμενα σωματίδια έχουν π.χ.

μικρό μέγεθος σε σχέση με το μήκος κύματος του ορατού φωτός, -προσδιορισμός φαρμάκων, π.χ.

αντιεπιληπτικά, λιδοκαΐνη, γενταμυκίνη (+ φάση σύνδεσης με λευκωματίνη) -παρακολούθηση της αύξησης μικροβίων -παρακολούθηση πολυμερισμού και καθίζησης -ποσοτική

ανάλυση πρωτεϊνών

στον ορό, π.χ..

σερουλοπλασμίνη, apoB, C3, C4, τρανσφερρίνη, αλβουμίνη,  κ.α.

Είναι πιο ειδική από τη θολωσιμετρία

ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ

 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ - ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ  ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ  ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ – ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑ

ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ποτενσιομετρία

Η μέτρηση της διαφοράς δυναμικού μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων ενός ηλεκτροχημικού στοιχείου, που συνδέονται μέσω του υπό εξέταση διαλύματος.

Η διαφορά δυναμικού είναι ανάλογη της C του ιόντος (π.χ. Κ, Να) 1. Οξειδοαναγωγικά ηλεκτρόδια 2. Ιοντοεπιλεκτικά • Γυάλινα: Κ, Να • Μεμβράνες: F, Cl, I 3. Αερίων 4. Ενζύμων (ουρία-ουρεάση, γλυκόζη-οξειδάση)

ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ποτενσιομετρία Εφαρμογές

 Προσδιορισμός pH   >> >> συγκέντρωσης ιόντων (Να, Κ, Ca, HCO 3 ) αερίων αίματος

ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ωσμωμετρία

Μέτρηση της

συγκέντρωσης των σωματιδίων

ενός διαλύματος, τα οποία συνεισφέρουν στην ωσμωτική πίεση του διαλύματος, ως προς τη μάζα του διαλύτη.

Εφαρμογές

Νεφρική λειτουργία Δηλητηρίαση από αιθανόλη Τοξικότητα φαρμάκων Εγκαύματα ΚΕΚ, για υγρά iv Υπερωσμωτικό διαβητικό κώμα

ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ

 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ  ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ - ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ  ΑΝΟΣΟΧΗΜΕΙΑ  ΘΟΛΩΣΙΜΕΤΡΙΑ – ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ  ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ  ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑ

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ

 Ομάδα μεθόδων για το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος, που μοιάζουν μεταξύ τους ως προς τις φυσικές και χημικές ιδιότητες, π.χ. πρωτεΐνες, αμινοξέα, σάκχαρα, βιταμίνες, φάρμακα  Μίγματα όπως  Βιολογικά υγρά  Πλάσμα  Ούρα  Εκχύλισμα ιστών

ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ

    Είναι σύστημα ΔΥΟ ΦΑΣΕΩΝ: σταθερής και κινητής.

Το δείγμα διοχετεύεται στην κινητή φάση ή εφαρμόζεται στη σταθερή Η κινητή φάση ρέει υπό πίεση κατά μήκος της σταθερής και παρασύρει το δείγμα Ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος στηρίζεται στο διαφορετικό βαθμό αντίδρασής τους με καθεμιά από τις φάσεις .

Αέρια Χρωματογραφία

Αέρια – Στερεή GSC Αέρια – Υγρή GLC

Υγρή Χρωματογραφία

Στήλης Επιφανείας

Χρωματογραφία στήλης Υγρή – Στερεή (LSC) Υγρή – Υγρή (LLC) Χρωματογραφία Επιφανείας Ανταλλαγής ιόντων Αποκλεισμού Λεπτής Στιβάδας (TLC) Χάρτου

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΥΝ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ

 Ρυθμός ροής της κινητής φάσης  Ρυθμός και βαθμός διαλυτότητας ουσιών στην κινητή φάση  Δυνάμεις κατανομής (GL – LL)  Δυνάμεις προσρόφησης (TLC)  Δυνάμεις ανταλλαγής ιόντων (στήλη ρητίνης)  Δυνάμεις αποκλεισμού – μέγεθος και σχήμα των μορίων (μοριακής διήθησης)

ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΑΕΡΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ

 Ποιοτική ανάλυση μειγμάτων  Ποσοτική ανάλυση μειγμάτων  Καθαρισμός ουσιών  Αυτόματη παρακολούθηση βιομηχανικών διαδικασιών με περιοδικό έλεγχο των αέριων αποβλήτων  Συνεχή μέτρηση ατμοσφαιρικών ρύπων, NO 2 , CO 2 , CO

ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ

Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

UV φασματό μετρο

Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

Εφαρμογές  Ποσοτική ανάλυση πρωτεϊνών, αμινοξέων (αμινογράμματα), λιπαρών οξέων, σακχάρων, ορμονών, βιταμινών, φαρμάκων, τοξικών ουσιών  Ποιοτικοί έλεγχοι  Περιβαλλοντικές αναλύσεις  Κλινικές δοκιμές

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ

Σταθερή φάση: πηκτή διοξειδίου πυριτίου, οξείδιο αργιλίου, κυτταρίνη, άμυλο ή ρητίνες ανταλλαγής ιόντων

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ

 Ανίχνευση συγγενών μεταβολικών νοσημάτων σε βρέφη και παιδιά  Επείγουσα αναζήτηση τοξικών ουσιών σε οξείες δηλητηριάσεις

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ

ΑΡΧΕΣ ΜΕΘΟΔΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ