Transcript TOCSY - NMR Lab, USTC

生物大分子波谱学原理
吴季辉
TOCSY
全相关谱TOCSY(total correlation
spectroscopy)也称HOHAHA
(homonuclear Hartmann-Hahn
spectroscopy)，可以提供整个自
旋体系的信息。
生物大分子波谱学原理
吴季辉
TOCSY
TOCSY
MLEV-17
Spin Lock
Product Operator:
Positive and absorptive diagonal & cross peaks for Z-filtered
anisotropic TOCSY
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吴季辉
TOCSY
生物大分子波谱学原理
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TOCSY
在TOCSY中用的混合脉冲有很多种类，如
WALTZ-16,MLEV-17,DIPSI-2,DIPSI-3等，不
同的isotropic mixing sequence的效率不同，适
合的谱宽也不同。
在混合脉冲期间还有ROE效应，因此有的
TOCSY序列中的混合脉冲包括一定的间隔，在
无脉冲的间隔中没有ROE效应，但有NOE效应，
由于蛋白质等大分子有ROE＝－2NOE，这样
适当选取间隔长度，可使二者基本抵销。这种
TOCSY序列称为Clean-TOCSY。
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TOCSY
C 实验及处理
•同相谱与COSY等反相谱不同，间接维的点数不必
很大，一般512点足够。
•混合时间的选择与要求的传递距离有关，传递距离
越长，需要的时间越长，一般短的可取20-30ms，
长的可取100ms左右。要注意：混合脉冲所用的功
率不能太大，尤其混合时间较长的。否则可能损坏
放大器及探头，另外混合脉冲产生的热量将使样品
发热，使得TOCSY的峰位同其他谱相比发生位移。
•由于TOCSY是同相谱，一般用相移60－90度的正
弦窗函数。
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吴季辉
TOCSY
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TOCSY
D 应用
TOCSY可提供整个自旋体系的连接，而且信号强，
对于谱峰证认很有用。
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吴季辉
TOCSY-wagergate
预饱和，
低功率选择性90脉冲（对准水峰）
生物大分子波谱学原理
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TOCSY-doublewagergate
d1恢复前梯度脉冲清除残留磁化，两个WATERGATE以改善基线
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TOCSY-enhance mode
180度脉冲
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第六章
同核核磁实验方法
COSY型实验
多量子谱
TOCSY
NOESY
ROESY
Selection of NOESY and ROESY
~1000
~3000
生物大分子波谱学原理
吴季辉
NOESY
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吴季辉
NOESY
NOESY
ˆ
Ix
ˆ
Ix
Iˆx
2
I1z   I1 y   I1 y cos1t1 
  I1z cos1t1
2
ˆ
Ix
2
NOE

  I 2 z cos1t1 
 I 2 y cos1t1
Mixing time: ~80% of T1
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NOESY
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NOESY
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NOESY
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NOESY
C 实验及处理
同TOCSY类似，间接维的点数不必很大，但考虑到NOESY积分的要求，最
好稍为大一些，一般取512－800点。累加次数也要大一些，以获得信噪比较好
的谱。
混合时间的选择很重要，从上述传递效率的关系式可知，在一定范围内，混
合时间小，交叉峰弱，混合时间越长，交叉峰越强。混合时间长到一定程度，
交叉峰反而变弱，称为出现了自旋扩散。只有在前者情况下（initial rate
regime），交叉峰强度才与混合时间以及两核间的交叉弛豫速率成正比，即此
时的交叉峰强度与两核间的距离的6次方成反比，这里假定适用各向同性的运动
翻滚模型。
一般由NOESY计算距离约束有两类方法：一种用已知距离的交叉峰积分为基
准，根据交叉峰强度与两核间的距离的6次方成反比的性质，来推算其他交叉峰
对应的距离，这时混合时间应该在initial rate regime范围内，以免自旋扩散的影
响；另一类直接利用交叉峰强度与弛豫矩阵的指数的关系，通过所谓的完全弛
豫矩阵迭代来计算弛豫速率以及对应的空间距离，这时混合时间可以长一些，
因为自旋扩散的影响已经包括在弛豫矩阵的指数函数中。一般在蛋白质结构计
算中常用第一种方法，而在核酸结构计算中常用第二种方法。
通常小蛋白质的NOESY的混合时间可以取得相对大一些，大蛋白质运动慢，
更容易产生自旋扩散，最大可取到100多ms。
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吴季辉
NOESY
零量子峰的强度受混合时间的余弦调制，所以混合
时间大，交叉峰强时，零量子峰的干扰就小，因此一般尽
可能取大一些的混合时间。混合时间小时，应当采取一定
措施抑制零量子峰，有若干不同的方案，基本上均利用零
量子峰的强度受混合时间的余弦调制这个性质。如混合时
间在一定范围内变化，累加所有结果；或者在m期间插入
一个180度脉冲，此时纵向磁化仅仅变号，而零量子项的
有效进动时间与180度脉冲的位置有关，若180度脉冲的位
置随t1随机变化，也可抑制零量子峰。
由于NOESY是同相谱，一般用相移60－90度的正弦
窗函数。
生物大分子波谱学原理
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NOESY
D 应用及其他
原则上，距离小于5埃的两个氢核都能
产生可观测的NOE交叉峰。NOESY既用于序
列证认，也用于获得距离约束。水峰预饱和
往往抑制水峰附近的信号，也使相关的交叉
峰强度变化，这时可采用其他手段，如jumpand-return，或用WATERGATE梯度场脉冲作
为观测序列。
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NOESY
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NOESY
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NOESY
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第六章
同核核磁实验方法
COSY型实验
多量子谱
TOCSY
NOESY
ROESY
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ROESY
由于实验室坐标系中的交叉弛豫速率在小
分子为正，在大分子为负，在中间大小的
分子如小肽接近零，因此小肽的NOE交叉
峰非常弱乃至消失。在这种情况下要得到
残基间的关联信息可以利用ROESY实验。
ROESY实验检测旋转坐标系中的交叉弛豫
速率，同NOE不同，ROE在所有相关时间
下均为正，因此即使NOE峰消失，ROE峰
仍能产生。
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ROESY
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ROESY
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ROESY
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ROESY
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ROESY
C 实验及处理
由于自旋锁定期间会产生TOCSY型的信号传
递，射频场功率要相当低，一般取2-5kHz，一方面
为了抑制TOCSY型峰，另一方面为了避免样品发热
及保护仪器，因为ROESY混合时间较TOCSY长。
同NOESY相比，混合时间可以短一些，因
ROE速率为NOE速率的二倍。
采样点数及适用的窗函数等与NOESY类似。
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ROESY
D 应用
主要用于分子量较小的多肽，较大蛋白
质的其他研究也可用ROESY，因自旋扩散对
ROESY的影响相对小一些，此外在ROESY中
交叉弛豫产生的交叉峰为负峰，而化学交换产
生的交叉峰呈正峰，因而可用于相关的研究，
其他一些类似的旋转坐标系中的核磁实验可用
于研究蛋白质分子的整体运动。
但在定量上，这类实验受频偏及其他因
素的影响较大。
生物大分子波谱学原理
吴季辉
同核相关谱谱形总结
以下列出本节讨论过的所有 (AX体系) 同核化学
位移相关谱的谱形。虽然每组共振峰都有4个峰，
但往往只有在DQF-COSY谱中能看到4个峰。对于
本节已讨论过的其它几个2D谱，如幅度COSY，
TOCSY，NOESY和ROESY，由于分辩率较低，这
4个共振峰往往合并成一个峰。
幅度COSY由于是幅度谱，因而是纯吸收的正峰，
不过其共振峰较相敏谱的来得粗一些，不能调相。
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吴季辉
同核相关谱谱形总结
幅度COSY由于是幅度谱，因而是纯吸收的正峰，不过其共振峰较相敏谱的来
得粗一些，不能调相。
对于相敏COSY和DQF-COSY，由于是通过反相分量产生相干转移而建立
起核与核之间的联系 (由交叉峰表现)的，因此其交叉峰是正、负交替的。
对于由反相分量而建立起的联系的谱，如幅度COSY，相敏COSY，DQFCOSY都是用正弦钟窗函数进行处理，以便加强交叉峰，削弱对角峰。
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吴季辉
同核相关谱谱形总结
对于TOCSY，NOESY和ROESY由于是通过同相分量而建立起核
与核之间的联系的，因此其交叉峰是同相的。
对于由同相分量而建立起联系的谱，如TOCSY，NOESY和
ROESY都用余弦窗函数进行处理，以便加强交叉峰而削弱对角
峰。
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吴季辉
同核相关谱实验设置
同核相关实验的设置如下：
幅度COSY：采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成；
相敏COSY：采集512个FID, 零填充后谱由2K2K个实数点组成；
DQF-COSY：采集512个FID, 零填充后谱由2K2K个实数点组成；
TOCSY : 采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成，
=15ms75ms；
NOESY ：采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成,
=150ms250ms；
ROESY ：采集256个FID, 零填充后谱由1K1K个实数点组成，
=150ms250ms；
以上数据适合于分子量小于10000的分子的实验。从中可看出，
由于相敏COSY和DQF-COSY的交叉峰是反相的，为了防止正负对
消，因而所用数据集较大。
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吴季辉
同核相关谱实验设置
在进行这些2D实验时，接收机的增益 (receiver
gain) 的设置值得注意。对于这三种COSY实验（幅
度COSY，相敏COSY，DQF-COSY），由于它们的FID信
号是调制的。因次，前面的一些FID的信号会很弱，
第一个FID（t1=0）的信号强度为零。但会逐步增强。
所以接收机增益的设置不能由前面的FID来确定，而
只能由后面的FID来确定，否则会由于接收机增益太
大而导致出现许多假峰。但对于TOCSY，NOESY和
ROESY实验，由于它们的FID是调制的，因此第一个
FID具有最强的信号强度。于是这三个实验的增益可
由它们的第一个FID的强度来确定。
生物大分子波谱学原理
吴季辉
同核相关谱实验设置
在实验中，NH-H交叉峰有可能缺失，导致NH-H交叉峰
缺失的原因和相应的解决方法如下：
1. 由于水峰的饱和导致水峰附近的H共振峰的饱和或
部分饱和而引起NH-H交叉峰缺失。这时可升高或降低温度
10C, 这时水峰移动显著，而H共振峰基本上不变；
2. 由于NH与H2O存在交换，当水峰饱和时，导致NH共
振峰部分饱和因而其强度下降。这可通过改变压水峰方法
(如改用或等)，降低温度和pH使交换变慢而避免；
3. 由于小的NH-H耦合常数或大的线宽导致的反相信
号的对消而导致的交叉峰缺失。这可通过降低样品的粘度
(如降低样品浓度或升高温度) 而减小线宽。
生物大分子波谱学原理
吴季辉
同核三维谱
从二维谱到三维谱的扩展是很自然的，因其有助于
拥挤谱峰的解析。最初进行的三维谱为同核三维谱。
同核三维谱相对于异核三维谱有很多不利之处：
因为氢谱谱峰数目多，加上重迭严重，要求的采样
点数多，这样的三维谱数据量大，采样时间长；氢
核间的J偶合常数不大，相干传递所需时间长，可能
由于弛豫衰减而无法实现；同核三维谱的谱峰数目
较二维谱明显增多，谱峰解析困难；由于没有用到
异核的信息，往往不足以解决谱峰重迭的问题，在
谱峰归属及序列证认方法上也不如异核三维谱。一
般将NOESY同TOCSY串接起来。