Transcript Hodowle tkankowe, komórki macierzyste

Hodowle tkankowe,
komórki macierzyste
Typy hodowli
Pierwszorzędowe = pierwotne
Wtórne
Linie komórkowe
Linie unieśmiertelnione
telomeraza
 onkogeny
 onkowirusy
 nowotworowe

Pojęcia
Medium = pożywka



Zdefiniowane
Niezdefiniowane
Bezsurowicze
Skład:






Aminokwasy – 9 egzogennych (His, Ile, Leu, Liz,
Met, Phe, Thr, Trp, Val); dodatkowo Cys, Gln, Tyr
Witaminy
Sole,glukoza
Surowica – zawiera insulinę, transferynę
Czerwień fenolowa
Dodatki: IL-2 dla limfocytów T, erytropoetyna dla
erytrocytów
Warunki hodowli
Temperatura
Tlen, dwutlenek węgla
pH
Wilgotność powietrza
Laboratorium
Hodowle imitujące
warunki fizjologiczne
• ko-kultury
• hodowle podtrzymujące
z ang. „feeder layers”
• hodowle 3D na odpowiednich
matrycach
• hodowle uniemożliwiające adhezję
Izolacja komórek
Oddzielenie od macierzy międzykomórkowej i rozbicie
na pojedyncze komórki
rozdrobnienie mechaniczne tkanki
trawienie enzymami proteolitycznymi
traktowanie EDTA –wiąże jony wapnia potrzebne do
kontaktu komórka-komórka
Rozbicie komórek
szok osmotyczny
ultradźwięki
przecieranie przez sita
homogenizacja
Rozdział frakcji
Cytometr przepływowy z sorterem
Chemotaksja
Adhezja
Wirowanie
Obecność markerów – antygenów
powierzchniowych
Tworzenie CFU
Cytofluorymetria
przepływowa z sorterem
MACS – rozdział immunomagnetyczny
Schemat izolacji
immunomagnetycznej
Selekcja
pozytywna
Selekcja
negatywna
Izolacja chemotaktyczna
Komórki jednojądrowe ze szpiku kostnego
Medium
SDF-1
HGF
LIF
Wirowanie
W gradiencie gęstości:


frakcje wędrują w
zależności od rozmiaru
i kształtu gdy użyje się
niskiego gradientu cukru
(5-20%);
w zależności od gęstości
frakcji, gdy użyje się
wysokiego gradientu cukru
(20-70%)
W gradiencie prędkości:

frakcje wędrują w
zależności od ciężaru –
im mniejsza frakcja tym
większej prędkości trzeba
użyć
Liczenie komórek
cytometr
Komora Burkera
Średnia ze zliczeń
Gęstość komórek /cm3:
C=n* 105
n- ilość zliczonych
komórek

Określenie żywotności
Błękit trypanu –
martwe-niebieskie jądra
Bromek etydyny –
martwe-jądra czerwone
Jodek propydynymartwe – jądro
czerwone
Dwuoctan fluoresceiny
– żywe – zielona
fluorescencja
cytoplazmy
Komórki macierzyste
Typy
Embrionalne ESC
 Somatyczne
 Z krwi pępowinowej

Cechy komórki
macierzystej
Nieograniczona
ilość podziałów
Zdolność
do różnicowania
Zdolność
samoodnawiania
Świat nauki 05/2002
Podziały
Bardzo rzadkie
Symetryczne
Asymetryczne
Regulacja
Świat nauki 07/1999
Typy komórek
macierzystych
Totipotencjalne
Pluripotencjalne
Multipotencjalne
Unipotencjalne
www.wi.mit.edu
Blastocysta
Blastocysta =
trofoblast + węzeł
zarodkowy
Trofoblast tworzy
łożysko
Komórki węzła
zarodkowego tworzą
3 listki zarodkowe
www.kumc.edu
Blastocysta
0,1 –0,2 mm
średnicy
100 –150 komórek
www.kumc.edu
Hodowla
Komórki węzła
zarodkowego
Warstwa odżywcza
z inaktywowanych
fibroblastów mysich
Surowica bydlęca
Świat nauki 06/1999
Różnicowanie mezenchymalnych
komórek macierzystych
MSC
Osteoblasty
Osteoklasty
zwiększenie aktywności
alkalicznej fosfatazy
tworzenie ognisk
mineralizacji
zmiana morfologii i
gromadzenie kropli
tłuszczu
zmiana morfologii i
odkładanie proteoglikanów
ESC
ZALETY:
WADY:
 Pluripotencjalne
 Trudna hodowla
 Nieprzewidywalny
 Zgodność
antygenowa –
brak odrzutu
kierunek
różnicowania
 Potworniaki 20%
 Problemy etyczne
Klonowanie
terapeutyczne
Jądro komórki
somatycznej
wprowadzane
do pozbawionego
jądra oocytu
Cytoplazma oocytu
„odmładza” jądro
Embrion hodowany
do stadium
blastocysty
www.biochem18.stanford.edu
Problemy
Źródło oocytów
Nieznana wydajność
tej techniki
Wydajność 14% na 1 linię 280 oocytów
Oocyty zwierzęce
www.lef.org
Partenogeneza
Niezapłodniony oocyt
pobudzany do rozwoju
Podwójny zestaw
chromosomów dawcy
oocytu
Komórki
pluripotencjalne
www.bedfordresearch.org
Odróżnicowanie
Izolacja enzymów
oocytu
„odmładzających” jądro
Iniekcja do komórki
hematopoetycznej
Komórki odzyskują
pluripotencjalność
www.ohsu.edu
Płodowe komórki
macierzyste FSC
5-9 tygodniowe
płody
Izolacja komórek
linii płciowej
Pierwotne komórki
zarodkowe EG
www.molbio.princeton.edu
Migracja ESC
do organizmu matki
Zaostrzenie chorób
autoimmunolo –
gicznych
Migracja do miejsca
uszkodzenia
i regeneracja tkanek
– ochrona matki
Świat nauki 12/2005
Krew pępowinowa
Alternatywne źródło
krwiotwórczych SC
Przeszczepy
autogeniczne
i allogeniczne
Możliwość bankowania
130 tys. porcji
zbankowanych
3500 przeszczepów
www.hemastem.com
Krew pępowinowa
ZALETY:
Dostępność i czas
Bezpieczna metoda
pobrania
Większa pula dostępnych
dawców
Młode SC
Mniej nasilone GvH
Minimalne ryzyko zakażenia
CMV
Brak dylematów moralnych
WADY:
Porcja 100 ml bezpieczna
dla biorcy 30 kg
Opóźnione zasiedlanie
szpiku
Ryzyko obciążeń
genetycznych
Nieznany wpływ bankowania
Mniej SC niż w szpiku i krwi
mobilizowanej
Możliwości
zastosowania krwi
pępowinowej
Leczenie białaczek
Leczenie pacjentów
po chemioterapii
lub radioterapii
Uzyskanie komórek
nerwowych
Uzyskanie komórek
mezenchymalnych,
trzustkowych i hepatocytów
www.waisman.wisc.edu
Banki krwi pępowinowej
PUBLICZNE:
Krew sklasyfikowana
pod względem HLA
Przeszczepy
allogeniczne
Ponoszą wszystkie
koszty
Ogólnodostępny rejestr
dawców
Dowolny biorca
KOMERCYJNE:
Przeszczepy
autogeniczne
lub w obrębie rodziny
Nie ponosi kosztów
Ryzyko zakończenia
działalności
i zniszczenia komórek
Somatyczne komórki
macierzyste
Niezróżnicowane
Ograniczona proliferacja
Liczba z wiekiem maleje
Efekt starzenia
Dostosowanie
do niszy tkankowej
Nie tworzą potworniaków
Stan uśpienia
www.rsna.org
Występowanie
somatycznych SC
szpik
mięśnie – komórki
satelitarne
skóra
jelito
wątroba
mózg
Wykorzystanie
somatycznych SC
ZALETY:
Brak dylematów
etycznych
Nie tworzą się
potworniaki
WADY:
Trudność pozyskania
Brak zgodności
tkankowej
Efekt starzenia
W stanach
chorobowych
lub martwicy mniejsza
liczba
Przeszczepy
Autologiczne
Allogeniczne
Ksenogeniczne
Narządów
Tkanek
komórek
Możliwości
wykorzystania
Badania embriogenezy
Badania
nieprawidłowego
rozwoju
Badania działania
genów
Testowanie leków
Badanie teratogenów
Zastosowania
medyczne
www.kumc.edu
Ograniczenia
Możliwość odrzutu
przeszczepu allogenicznego
Linie hodowane
na mysich fibroblastach
i surowicy cielęcej –
możliwość transmisji
patogenów
SC pobierają mysie białko
i prezentują je na swojej
powierzchni – odrzucenie
przeszczepu
Trudności uzyskania,
hodowli i różnicowania
Kontrowersje etyczne
www.zaman.com
Oparzenia
Skóra wyhodowana
in vitro dostępna
komercyjnie
Przeszczep odtwarza
włosy i gruczoły łojowe
Prawidłowy układ strefy
wzrostu
www.times.hankooki.com
Zawał serca
W Polsce 100 tys. rocznie
Nekroza kardiomiocytów
Blizna łącznotkankowa
Przebudowa ściany
Świat nauki 12/2004
SSC w terapii pozawałowej
-próby przedkliniczne
Myszy, szczury, owce,
świnie
Poprawa kurczliwości
Indukcja angiogenezy
Prawidłowe ułożenie
Ochrona przed dalszą
degeneracją
Po miesiącu 38% blizny
zastąpione tkanką
mięśniową
www.worldhealthspecialists.org
Badania kliniczne
Poznań i Paryż
Podanie podczas bypassów
lub przezskórnie
Makrofagi + SC
Większość komórek
nie przeżywa
Zwiększenie frakcji
wyrzutowej z 35% do 42%
www.dir.nhlbi.nih.gov
Cukrzyca typu I
SSC trzustkowe
Różnicowanie ESC
w komórki wysepek
trzuskowych
Produkcja insuliny
Możliwy przeszczep
w nie fizjologicznej
lokalizacji –
pod torebkę nerki
www.stemcells.nih.gov
Uszkodzenia wzroku
Stosowana terapia
SSC z rąbka rogówki
In vitro hodowana
błonka wszczepiana
w miejsce uszkodzenia
Oparzenia rogówki
www.stemcell.umn.edu
Choroba Parkinsona
ok. 300 pacjentów
ESC lub SSC
Tworzyły połączenia
neuronalne, produkcja
dopaminy
50% redukcja objawów
Efekt utrzymywał się
przez 5-10 lat
90-95% komórek zamiera
po przeszczepie
Na 1 pacjenta potrzeba
6 płodów
www.stemcells.nih.gov
Udar mózgu
oraz uszkodzenia
rdzenia kręgowego
Podanie dożylne
Angiogeneza,
neurogeneza,
regeneracja
funkcjonalna
Wydzielają czynniki
neuropoezy
www.rsna.org
Zęby
Badania na myszach
SC z miazgi zębów mądrości
15 – 20% miało prawidłowy
układ tkanek
Ograniczenia:




Źródło
Rozwój w szczęce
dorosłego
Tworzenie korzeni
Przewidywalna wielkość
i kształt
Świat nauki 9/2005
Hodowla narządów
Nerka:



Autologiczna
Na kolagenowym
rusztowaniu
Po 12 tygodniach
produkowała mocz
Wątroba
Pęcherz moczowy
www.obgyn.net
CD34+
CD133+
CD33+
2,5%
1,1%
45%
CD71+
CD105+
6%
0,7%
CD19+
CD14+
CD3+
24%
7,8%
34%
marker SC
marker SC
marker komórek
hematopoetycznych
marker limfocytów
marker komórek
szpiku
marker limfocytów B
marker monocytów
marker limfocytów T