BTS Analyses de Biologie Médicale Cours de Microbiologie (1e année) Chapitre n°6 : Les agents antimicrobiens [email protected]

1. Définitions et généralités

Stérilisation Désinfectants Antiseptiques Antibiotiques Spectre d’activité Bactériostase / Bactéricidie CMI / CMB

Croissance bactérienne en présence d’antibiotique

Découverte des antibiotiques par Fleming

Les micro-organismes producteurs d’antibiotiques PROCARYOTES Bactéries : * Streptomyces (Actinomycètes) * Bacillus EUCARYOTES Moississures : * Penicillium Streptomycine Erythromycine Kanamycine Néomycine Nystatine… Bacitracine Polymixines Pénicilline Griséofulvine

Les rapports entre malade, agent infectieux et antibiotique

2. Classification des antibiotiques

Mode d’action des antibiotiques : la notion de cible

2.1. Les b -lactamines

Structure des b -lactamines Les béta-lactamines sont caractérisées par un cycle

béta-lactame

associé à un noyau thiazolidine formant l’acide 6-amino-pénicillinique (

pénicillines

) ou à un noyau dihydrothiazine formant l’acide 7-amino-céphalosporanique (

céphalosporines

). Ces antibiotiques, actifs lorsque les bactéries sont en phase de croissance exponentielle,

inhibent la synthèse de peptidoglycane

, et plus particulièrement la réaction de pénicilline (

transpeptidation PLP

ou

PBP

. Les béta lactamines se fixent sur des protéines liant la ) : ce sont principalement des enzymes (carboxypeptidases) qui interviennent dans l’assemblage du peptidoglycane. Les béta-lactamines activent également les

autolysines

bactériennes.

Mode d’action des b -lactamines

2.2. Les glycopeptides Mode d’action :

2.3. Les aminosides 2.4. Les macrolides et apparentés

Mode d’action des aminosides et des macrolides

2.5. Les phénicolés 2.6. Les tétracyclines Mode d’action du chloramphénicol (CP) et des tétracyclines

2.7. Sulfamides et du triméthoprime Mode d’action des sulfamides et du triméthoprime

2.8. Quinolones Mode d’action

2.9. Autres antibiotiques

3. L’antibiogramme L’

antibiogramme

a pour but de déterminer

in vitro

l’antibiotique le plus actif sur le germe, c’est à dire celui qui sera prescrit au malade infecté par ce germe. Un certain nombre de facteurs susceptibles de modifier l’activité antimicrobienne de l’agent testé doivent être pris en compte :

L’antibiotique

: il doit conserver son activité au cours du test (à 37°C) et sa capacité de diffusion en milieu gélosé solide doit être convenable.

- Le milieu

: sa composition doit être rigoureusement définie pour que les résultats soient reproductibles.

Les bactéries

: le nombre de bactéries mises au contact de l’antibiotique devrait toujours être le même. L’activité métabolique de la bactérie et la durée d’incubation sont des facteurs importants aussi. La mesure de l’activité antimicrobienne s’effectue toujours avec des

souches pures

.

Mueller Hinton (Gélose) Usage : Gélose riche pour la réalisation de l'antibiogramme standard Composition :

infusion de viande de bœuf 300,0 ml peptone de caséine 17,5 g amidon de maïs 1,5 g agar 17,0 g pH = 7,4

Préparation :

38 g par litre. Stérilisation à l'autoclave.

Lecture :

Cette gélose standardisée est la gélose permettant de tester l'action des antibiotiques sur les bactéries. Elle peut être additionnée de sang (pour les

Streptococcus

), d'extrait globulaire (pour

Haemophilus

), Elle doit être coulée en boîte de façon à obtenir une épaisseur de 4 mm. Il existe un bouillon équivalent.

Courbe de concordance Les

méthodes par diffusion

en milieu gélosé solide permettent d’observer des

zones d’inhibition

autour des sources d’antibiotiques. Il existe une relation linéaire entre le diamètre de la zone d’inhibition et le logarithme de la concentration au niveau de la source. En effet, l’antibiotique diffuse dans le milieu selon un gradient de concentration inversement proportionnel à la distance du dépôt du disque imprégné d’antibiotique. Pour établir la relation entre le diamètre de la zone d’inhibition et la CMI, on utilise des courbes de concordance établies par des laboratoires spécialisés (Institut Pasteur) avec des souches de référence.

Interprétation Un germe est dit

sensible

si la CMI de l’antibiotique pour le germe est plus faible que la

concentration critique inférieure

(taux sanguin moyen obtenu aux posologies habituelles et sans danger pour l’organisme). Un germe est dit

de sensibilité intermédiaire

si la CMI de l’antibiotique pour le germe est à l’intérieur de la zone des taux thérapeutiques, c’est à dire entre la

concentration critique inférieure

et la

concentration critique supérieure

(taux sanguin maximal obtenu par l’administration de fortes doses). Un germe est dit

résistant

si la CMI de l’antibiotique pour le germe est plus élevée que la

concentration critique supérieure

antibiotique donné.

. Il faut distinguer cette résistance clinique de la résistance absolue d’un microorganisme vis-à-vis d’un

E-Test Il s'agit d'une technique de détermination de la CMI fondée sur l'utilisation de bandelettes imprégnées d'un gradient exponentiel prédéfini de l'antibiotique à tester. L’E-test associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes sont des supports inertes, hydrophobes. Elles sont appliquées sur la surface d'une gélose préalablement ensemencée avec la souche à étudier. Après incubation, l'inhibition de la croissance bactérienne se traduit par la présence d'une ellipse dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI. Une échelle de lecture imprimée sur la face supérieure de la bandelette permet une interprétation rapide.

Résultat d’un « E-test » pour la pénicilline G (concentrations exprimées en µg.mL

-1 )

Antibiogramme miniaturisé en milieu liquide (ATB Gram-)

4. Association d’antibiotiques

Association d’antibiotiques : schéma triangulaire

5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques

5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques

Pour qu'un antibiotique soit actif, il faut :

- qu'il pénètre dans la bactérie

Pour résister à l’antibiotique, la bactérie peut :

- devenir imperméable ou s'opposer à son transport - l’excréter activement - qu'il ne soit ni modifié ni détruit - qu'il se fixe à sa cible - synthétiser des enzymes qui le modifient - synthétiser des enzymes qui l'hydrolysent - synthétiser des protéines qui le séquestrent - modifier le site de reconnaissance de la cible - produire la cible de façon plus importante - qu’il bloque une voie métabolique - changer de voie métabolique

• 5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques –

L'imperméabilisation

Elle concerne la membrane externe (pour les bactéries à Gram négatif) ou la membrane cytoplasmique (pour toutes les bactéries). C'est le mécanisme le plus souvent responsable de la résistance naturelle . Il peut concerner tous les antibiotiques.

• • –

Modification de la cible

C'est un mécanisme dont l’origine génétique est souvent mutationnelle. La cible est légèrement modifiée par la substitution d'un acide aminé dans la protéine (s'il s'agit d'une enzyme ou d'une protéine ribosomale) ou la substitution d'un nucléotide (s'il s'agit de l'ARN ribosomal). Il peut concerner les b-lactamines, les aminosides, les macrolides, les quinolones… On peut rencontrer ce mécanisme dans la résistance plasmidique : dans le cas des macrolides, une méthylase modifie deux nucléotides du ribosome qui perd son affinité pour l'antibiotique. Dans le cas des sulfamides ou du triméthoprime, le plasmide code pour des isoenzymes qui ne fixent pas ces molécules.

• • • • • 5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques –

L'inactivation ou la modification de l’antibiotique

C'est un mécanisme dont l’origine génétique est souvent plasmidique. Il concerne particulièrement : les béta-lactamines :

béta-lactamases

(pénicillinases, céphalosporinases) hydrolysant la molécule, - les aminosides :

transférases

la molécule, les phénicolés :

transférase

qui phosphorylent ou acétylent certains sites de qui acétyle la molécule.

On peut rencontrer ce mécanisme dans la résistance mutationnelle : certaines bactéries synthétisent des faibles quantités de

béta-lactamases

(la résistance est alors dite de

bas niveau

). Une mutation altère le gène de régulation et provoque une synthèse accrue de l’enzyme qui est dite

déréprimée

(la résistance est alors dite de haut niveau).

6. Déterminisme génétique des résistances aux antibiotiques

Résistance naturelle (chromosomique) : caractère d’espèce

La résistance naturelle est caractéristique d’une espèce bactérienne. Elle délimite le spectre naturel de l'antibiotique et constitue une aide à l’identification.

La résistance naturelle se traduit habituellement par des CMI supérieures à la valeur critique basse de concentration (c) de l’antibiotique concerné.

Les protéines codées par le chromosome ont une structure telle qu'elles empêchent la pénétration de l'antibiotique (les membranes sont imperméables, un système de transport est absent) ou l'inactivent (les

béta-lactamases

chromosomiques).

6. Déterminisme génétique des résistances aux antibiotiques

Résistances naturelles

6. Déterminisme génétique des résistances aux antibiotiques

Résistances acquises : seules certaines souches d’une espèce sont concernées

Les

résistances acquises

hôpital…).

, sont consécutives à des modifications de l'équipement génétique chromosomique ou plasmidique, qui ne concernent que quelques souches d'une même espèce mais peuvent s'étendre : leur fréquence varie dans le temps mais aussi dans l'espace (région, ville, •

Résistance mutationnelle (chromosomique)

Une altération de l’ADN chromosomique entraîne la synthèse de protéines modifiées : les membranes deviennent imperméables, un système de transport n'accepte plus l'antibiotique, la cible (enzyme ou ribosome) ne fixe plus l'antibiotique, un répresseur ne contrôle plus certains gènes (dérépression des béta-lactamases).

Les résistances mutationnelles sont : spontanées : elles préexistent à l'utilisation de l'antibiotique, stables : elles se transmettent verticalement dans le clone bactérien, spécifiques : elles ne concernent qu'un antibiotique ou une famille d'antibiotiques à la fois,

-

rares : le taux de mutation se situe habituellement entre 10 -7 et 10 -8 .

6. Déterminisme génétique des résistances aux antibiotiques

Résistance extra-chromosomique (plasmidique ou liée à un transposon)

L'acquisition d'une information génétique supplémentaire permet la synthèse de protéines additionnelles dont la présence modifie les membranes ou dont l'activité enzymatique se révèle capable de modifier la cible ou d'inactiver l'antibiotique. Les

résistances extra-chromosomiques

ont pour support génétique un

plasmide

(ou un

transposon

) acquis par

conjugaison

ou plus rarement par

transduction

ou

transformation Les résistances plasmidiques : sont fréquentes (plus de 80% des résistances acquises), sont contagieuses et se transmettent horizontalement entre bactéries cohabitant dans un même environnement, même entre espèces différentes,

-

peuvent concerner plusieurs antibiotiques, voire plusieurs familles d'antibiotiques, entraînant une multirésistance.

L'usage d'un seul antibiotique dont la résistance est codée par un gène plasmidique sélectionne les souches résistantes à toutes les molécules dont le gène de résistance se trouve sur le plasmide, ce qui entraîne

la sélection rapide de souches multirésistantes

. Ce sont ses souches bactériennes résistantes à plusieurs familles d'antibiotiques pour lesquelles les possibilités thérapeutiques sont réduites et parfois anéanties. On constate, en milieu hospitalier surtout, une recrudescence de la fréquence d'isolement de ces souches qui doivent être détectées rapidement et signalées car elles imposent aux services d'hospitalisation des mesures strictes pour éviter leur diffusion. Certaines espèces bactériennes sont plus particulièrement concernées par cette multirésistance :

Staphylocoques méticillino-résistants

(SARM)

Souches de Pseudomonas

productrices de céphalosporinase déréprimée

Entérobactéries

productrices de

b lactamase à spectre étendu

(«

BLSE

»)

Acinetobacter

(dont l’espèce

A. baumannii

) naturellement résistants à de nombreux antibiotiques

7. Mise en évidence des résistances acquises au laboratoire

Mise en évidence des béta-lactamases

Les

béta-lactamases

hydrolysent le Les béta-lactamases peuvent être :

cycle b-lactame

des pénicillines (

pénicillinases

) et des céphalosporines (céphalosporinases) avec plus ou moins de spécificité, les rendant ainsi inactives.

constitutives

(

Haemophilus influenzae

,

Neisseria

…) ou

inductibles

d’origine

chromosomique

ou

plasmidique

.

(

Staphylococcus aureus

) ; Il existe une méthode simple de mise en évidence rapide de ces enzymes : la méthode à la céphalosporine chromogène. Le test

Céfinase

® de BioMérieux est réalisé grâce à un disque imprégné d’un

substrat chromogène

(la

nitrocéfine

) sur lequel on dépose une colonie bactérienne : en présence de béta-lactamase, il se forme un produit coloré rouge.

7. Mise en évidence des résistances acquises au laboratoire

Mise en évidence des béta-lactamases à spectre étendu (BLSE)

Les

béta-lactamases à spectre étendu confèrent une résistance de haut niveau à quasiment toutes les béta-lactamines, à l’exception des céphalosporines de 3

transmissibles entre bactéries).

e génération

(résistance de bas niveau). Les BLSE sont déterminées génétiquement par des plasmides (et sont donc

Elles sont inactivées par les inhibiteurs de béta-lactamase

tels que l’

acide clavulanique

. Leur mise en évidence repose sur la présence d’une synergie entre une céphalosporine de 3 e génération (Céfotaxime ou Ceftazidime par exemple) et un inhibiteur de b lactamase (on utilise souvent le disque AMC contenant de l’amoxicilline et de l’acide clavulanique).

7. Mise en évidence des résistances acquises au laboratoire

Mise en évidence des béta-lactamases à spectre étendu (BLSE)

7. Mise en évidence des résistances acquises au laboratoire

Résistance des staphylocoques aux béta-lactamines

Il s’agit d’une résistance à la

méticilline

due à une

modification des PLP

résistantes » ou « SARM » :

Staphylococcus aureus

(souches dites « méticillino résistant à la méticilline). L’acquisition d’un

gène chromosomique mecA

entraîne une production de

PLP 2a

(

dont l’affinité vis à-vis des béta-lactamines est faible

résistance (d’où le nom de ). La mise en évidence de cette résistance est délicate, car seulement une partie de la population bactérienne (1 bactérie sur 10 000 à 100 000) exprime cette

résistance hétérogène

). Les conditions de culture doivent être modifiées (incubation à 30°C ou ensemencement en milieu Mueller-Hinton hypersalé) pour observer des colonies dans la zone d’inhibition autour d’un disque d’oxacilline.

7. Mise en évidence des résistances acquises au laboratoire

Résistance des staphylocoques aux béta-lactamines

7. Mise en évidence des résistances acquises au laboratoire Il s’agit d’un test général mettant en évidence toute réaction d’inactivation d’un antibiotique. Une souche sensible à l’antibiotique testé est ensemencée sur un milieu Mueller-Hinton. Un disque imprégné de l’antibiotique testé est placé au centre de la boîte. Des stries sont réalisées autour du disque avec les souches à tester et des souches témoin. Après incubation, la présence de culture de la souche sensible au contact des souches test ou témoin dans la zone d’inhibition témoigne de l’inactivation de l’antibiotique.

Bibliographie : Microbiologie technique

,

1. Dictionnaire des techniques , Jean-Noël JOFFIN, Guy LEYRAL, CRDP Bordeaux, 2001.

Le paradoxe des antibiotiques , Stuart B. LEVY, Editions Belin, 1999.

Pour la science : - n - n

°

232 (février 1997) : - n

°

331 (mai 2005) : résistance des bactéries ».

La recherche :

°

384 (mars 2005) : « La résistance des bactéries aux antibiotiques ».

« Les infections à l’hôpital » ; « Consommation d’antibiotiques et « Le grand désert des antibiotiques ».

Sites internet : Les ressources en ligne sont extrêmement nombreuses sur le sujet (tapez « antibiotiques » ou « antibiogramme » sur Google par exemple), mais il faut sélectionner les sites les plus rigoureux. Quelques suggestions : http://www.123bio.net/cours/ http://www.frm.org/ (tapez « antibiotiques » dans le champ de recherche en haut à droite).

http://www.microbes-edu.org/etudiant/etudiants.html

http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/atbq/sensibilite.html

http://anne.decoster.free.fr/ http://pedagogie.ac-montpellier.fr/Disciplines/sti/biotechn/microbio.html

http://biomserv.univ-lyon1.fr/wiki/dpbcoursd1/moin.cgi/Antibio Fichiers « pdf » à télécharger (cours de l’Université de Genève) : http://www.unige.ch/sciences/biologie/public/pif/polycop.htm