Transcript Vztah mezi množstvím DNA na buňku a počtem buněčných typů

Mimojaderné genetické
elementy
Genom plastidů a mitochondrií
Vlastnosti semiautonomních
organel
• ohraničení dvouvrstevnou membránou
• množení dělením
• vlastní DNA a ribozomy (70S)
– syntéza malé části vlastních proteinů
– přesun genů do jaderného genomu
• endosymbiotického původu
• úloha v energetickém metabolismu
Původ plastidů a mitochondrií
*
Pozn.: strom eukaryot byl modernizován
Gillham 1994
Primární, sekundární a terciární endosymbióza
– různé počty membrán (příp. nukleomorf)
Primární (1,6 mld let):
- Glaucophyta
- Rhodophyta
- Chlorofyta
Glaucophyta
Sekundární:
- Euglenophyta
- Chlorarachniophyta
- Chromalveolata
Primární,
sekundární a
terciární
endosymbióza
(Keeling 2010)
Transientní endosymbióza
(plž Elysia chlorotica)
- aktivní chloroplasty
řasy Vaucheria
chloroplasty zůstávají
aktivní po dobu 8 měsíců
(jak fungují???)
gen kódující protein MSP
(PsbO) přítomen v
genomu plže !!!
(Rumpho et al. 2008 PNAS)
ale zřejmě
extrachromozomálně!
(Bhattacharya et al. 2013)
Rumpho M. et al., 2000
Funkce plastidů
fotosyntéza
– konverze světelné energie
– asimilace uhlíku
redukce sulfátu a nitritu
syntéza škrobu
syntéza mastných kyselin
syntéza aminokyselin
syntéza nukleotidů
syntéza pigmentů
+ syntéza nukleových kyselin, proteinů
Stromuly chloroplastů (tubulární útvary)
- výměna genetického materiálu a proteinů?
- komunikace s jinými organelami (ER, mitochondrie?)
Schattat M et al. Plant Cell 2012;24:1465-1477
Hanson M, Sattarzadeh A. Plant Cell 2013;25:2774-2782: … a přece se přenášejí (?)
Mitochondrie
Vnitřní membrána:
- dýchací řetězec
- ATP syntáza
Matrix:
- Krebsův cyklus
- tvorba ATP a uhlíkových skeletů pro anabolické dráhy
- disipace přebytku redukovaných koenzymů
- další role v indukci PCD, skladování Ca2+
Reprodukce dělením
PLASTIDY:
Kombinace prokaryotického
FtsZ a eukaryotického
dynaminového kroužku
Vnitřní:
1. FtsZ
2. FtsZ + dynamin
3. Dynamin
Vnější: Dynamin (role ER?)
Lopez-Juez E., 2007
MITOCHONDRIE: u vyšších rostlin asi FtsZ chybí, další faktory, role ER
Plastom a chondriom
versus jaderný genom
Funkce genů v plastomu (a chondriomu)
+ geny pro rRNA a tRNA (u mitochondrií některé chybí!)
Lokalizace proteinů kódovaných jádrem
(predikce Target P u Arabidopsis – Emanuelsson et al., J Mol Biol)
Mitochondrie ~ 10% (cca 2500 genů)
Plastidy
~ 14% (cca 3500 genů)
Celkem cca 1/4 genů nutná pro fungování organel
- mnoho z těchto genů ale primárně nepochází z daného endosymbionta
(tj. původem jsou jaderné či z druhého endosymbionta)
- mnoho genů (proteinových produktů) využito pro jiné funkce v buňce
Osudy genů
endosymbionta
Arabidopsis
nukleom: cca 26 tis.
plastom: 87
bílkovin v plastidu: ~ 3500
Předpokládaný endosymbiont
cca 4500 genů
(analogie dnešní sinice:
cca 3000 – 7000 genů)
Leister D., TRENDS in Genetics 19: 47, 2003.
Předpokládané příčiny přenosu
organelových genů do jádra
- možnost komplexnější regulace exprese genů a
buněčných aktivit
- možnost využití genů pro druhotné funkce
- vyšší mutační rychlost v organelách (x jádru – pohlavní množení)
- nemožnost rekombinace (opravy mutací)
ALE zachované geny jsou vysoce konzervované
(možnost rekombinace mezi molekulami)
- nemožnost „bezpečného testování nových mutací“
Produkty přenesených genů musí být importovány
zpět do příslušné organely (jsou-li tam potřeba)!
Transport proteinů do plastidu
majoritně:
TOC-TIC translokony
= kanály + chaperony!
(mitochondrie: TOM-TIM)
Transitní peptid: 30-100 amk
(2-4 tis. proteinů),
Inaba and Schnell; Biochem J (2008)
OM – outer membrane
ER-CP – glykoproteiny
Uncleaved TP
Transport do tylakoidů
Lumen: prokaryotické transportní systémy
Tylakoidní membrána – spontánní inkorporace (společně s plastidově
kódovanými proteiny)
Recentní funkční
přesuny genů do jádra
(získá-li protein transitní peptid, může
postupně vymizet z organelového
genomu)
• Fúze se signální sekvencí genu,
jehož produkt je již importován
• Příklad: mitochondriální Rps11
paralogy rýže kódované jádrem
využívají signální sekvence Cox,
a podjednotky mitochondriální
ATPázy
(zbytky mt genu jsou stále transkribovány)
Kadowaki et al., EMBO J. 1996
Recentní funkční přesuny
• Inzerce do genu, jehož
produkt je importován, a
alternativní sestřih
zachovávající též původní
produkt
• Příklad: mitochondriální
Rps14 kódovaný jádrem u
rýže v genu pro sdhB
sukcinátdehydrogenázu B
Kubo et al., PNAS 96:9207, 1999
Proč si organely některé geny
udržely?
Většinou transmembránové proteiny
– asi problém s transportem či balením
Přenos DNA z organel do jaderného
genomu je stále aktivní proces!!!
- rostlinné jaderné genomy obsahují velké množství
organelové (plastidové) DNA
- i z recentních integrací (kopie celých plastidových genomů)
- u rýže celkově přes 800 kbp
Přenosy genů z organel
v experimentálních podmínkách u tabáku
pozorována velmi vysoká frekvence přenosu
transgenu z plastidu do jádra
- v somatických buňkách
- v pylu (degradace plastidů!)
- ve vaječných buňkách
1 z 18.000
1 z 11.000
1 z 250.000
Dědičnost organelové DNA
Dědičnost zpravidla uniparentální (většinou z mateřské
buňky) několik mechanismů, nejasné:
•
Chlamydomonas, otcovská organelová DNA
eliminována pravděpodobně vlivem metylace na
replikační schopnost organelového genomu
(jinak metylace DNA ani RNAi v organelách neprobíhá)
•
některé vyšší rostliny – otcovské plastidy
eliminovány při oplodnění
•
nahosemenné rostliny – paternální přenos plastidů
Plastidová DNA (cpDNA)
•
•
•
•
•
•
dsDNA, cirkulární (snad základní forma)
obsah G-C zpravidla nižší než v jádře
bez histonů, navázány proteiny (Hu),
organizace do nucleoidů
20-40 plastidů/jaderný genom
velké množství kopií (~30-100) na plastid
tvoří 10-20% celkové DNA v listech
- postupně se ztrácí!
Typický cp genom – základní uspořádání
kruhová molekula DNA
rozdělena na „long“ a
„short“ oblasti (LSC a SSC)
jedinečné oblasti,odděleny
IR
rRNA (rrn) a tRNA (trn)
geny (uspořádání v
clusterech připomíná
uspořádání v E. coli)
rekombinace mezi
repeticemi (oddělují LSC a
SSC) vede k převrácení
SSC
Strukturní komplexita plastidové DNA
Table 1. Frequency of Different cpDNA Structures across All Experiments in Three
Species
No. of Observations
Structurea
Arabidopsis
Tobacco
Pea
Circular
126 (42%)
524 (45%)
59 (25%)
Linear
68 (23%)
250 (22%)
85 (36%)
Bubble/D-loop
25 (8%)
67 (6%)
5 (2%)
Lassolike
34 (11%)
115 (10%)
21 (9%)
Unclassifiedb
44 (16%)
203 (17%)
66 (28%)
a Each classification represents all molecules of that type regardless of size.
b DNA fibers that were coiled or folded and could not be classified
[Lilly et al. Plant Cell. 13:245]
Velikost plastidového
genomu
• 70 - 300kb
• vyšší rostliny 120 – 200 kb
Velikost genomu mitochondrií
• S. cerevisiae
84 kb
• savci
16 kb
(produkty podobné)
• vyšší rostliny stovky tisíc kb
(x řasy – malý chondriom 16 kb)
mechanismus evoluce:
ekonomizace u řas či nárůst u vyšších rostlin
Genom mitochondrií
Genom
mitochondrií
kukuřice (Zea mays):
několik kruhových molekul:
„master“ molekula (570 kb):
- subgenomické kruhové
molekuly odvozené
od „master“
subgenomické vznikají
rekombinací mezi stejnými
repeticemi (šipky)
Komplexita mt DNA
- důvod?
Backert et al. Trends Plant Sci 2:478
Lineární a lasovité (sigmoidální) molekuly vznikají replikací valivou kružnicí
Exprese chloroplastového genomu
většinou uspořádání do operonů – kotranskripce
Polycistronní RNA
psbB
psbT
psbH
petB
Intron
psbN
Monocistronní RNA
petD
Intron
- další zpracování na dílčí úseky
(stabilní ribonukleoproteinové jednotky)
plastidy vyšších rostlin asi 30 transkripčních jednotek
(vymezeny promotorem a terminátorem)
- dvě polymerázy PEP, NEP (plastid, nucleus-encoded pol.)
- promotory pro PEP podobné bakteriálním (sekvence –10 a –35)
- většinou promotory pro obě polymerázy
transkript není až na výjimky modifikován čepičkou ani
polyadenylován, u některých dochází k editaci (velmi zřídka)
transkripční jednotky
plastidového genomu
Model exprese psbB operonu
Barkan A. Plantphysiol 2011;155:1520-1532
- významná role pentatricopeptide-repeat proteinů (i v editování)
Transkripční regulace exprese u
chloroplastů
1. celková (NEP→PEP)
– exprese většiny genů se zvyšuje / snižuje ve
stejném okamžiku
2. genově specifická regulace
sigma faktory pro PEP
př.psbD/psbC promotor reaguje na světlo
Kontrola exprese chloroplastové DNA
- PEP a NEP - vzájemná regulace, překryvné, (ne)zastupitelné
- jaderně kódované sigma faktory PEP komplexu
(některé  společné pro plastidy i mitochondrie, transkripci většinou
spouští více )
σ
Regulace jaderných genů,
jejichž produkty se uplatňují v plastidech
signály od plastidu směrem k jádru „zasahují“ promotorové
oblasti genů, které se účastní odpovědi na světlo
- reakce na měnící se (a často stresové) podmínky
- plná exprese podmíněna přítomností funkčních plastidů
(při špatném vývoji nebo poškození plastidů jsou jaderné geny pro proteiny
fotosyntézy exprimovány velmi slabě)
Signály:- prekurzor biosyntézy chlorofylu
- funkční plastidová genová exprese (při přechodu
z heterotrofie na autotrofii)
- komponenty elektronového transportu fotosyntézy
- redox signalizace (Trx, GSH, askorbát, …)
- metabolity
- ROS
Exprese mitochondriálního
genomu
- zřejmě jen NEP, regulace velmi komplexní (i počty kopií)
- transkript není modifikován čepičkou ani polyadenylován
- transkripty velmi často „editovány“
RNA Editing
– objeven právě u mitochondrií rostlin
– i u některých chloroplastových genů vyšších rostlin
Definice: jakýkoli proces (kromě sestřihu), který způsobí
změnu v RNA sekvenci, tak že je odlišná od
komplementární sekvence DNA
Editace transkriptů v organelách
přeměna C na U
cytosin deamináza
nebo výměna
(odstranění)
nukleotidové báze
•
•
•
mnoho mitochondriálních transkriptů editována (tRNA, i
protein kódující)
přeměna zejména C na U (zřídka opačně)
guide RNA a editozóm (role PPR proteinů, mechanismus?)
Introny organel
•
Stejný gen v různých druzích může mít různé introny
ve stejné pozici
•
Stejné nebo podobné introny nacházeny v
nepříbuzných genech a druzích (introny I. a II. typu)
•
Neobvyklá distribuce a fylogenetická analýza
potvrzují, že byly získávány a ztráceny v
celém průběhu evoluce
Jaderný a organelové genomy se doplňují
(procházejí koevolučními změnami)
omezená kompatibilita genomu a plastomu u mezidruhových
hybridů pupalky Oenothera sp. (biparentální přenos plastidů)
- regulace exprese,
- editace, …
Genes Encoded in the Chloroplast Genomes in Higher Plants
Gene Designation
Gene Product
I. Genetic System
Chloroplast RNA genes
rDNA
trn
Gene transcription
rpoA, B, C
ssb
Protein synthesis
rps2,3,4,7,8,11
rps12, 14, 15, 16, 18, 19
rpl2, 14, 16, 20, 22
infA
II. Photosynthesis
Photosynthetic proteins
rbcL
atpA, B, E
atpF, H, I
psaA, B, C
psbA, B, C, D, E
psbF, G, H, I
petA, B, D
Respiratory proteins
ndhA, B, C, D
ndhE, F
III. Others
Maturase
Protease
Envelope membrane protein
Ribosomal RNAs (16S, 23S, 4.5S, 5S)
Transfer RNAs (30 species)
RNA polymerase a, b, b’ subunits
ssDNA-binding protein
30S ribosomal proteins (CS) 2, 3, 4, 7, 8, 11
CS12, 14, 16, 18, 19
50S ribosomal proteins (CL) 2, 14, 16, 20, 22
Initiation factor I
RUBISCO large subunit
ATP synthetase CF1a, b, e subunits
ATP synthetase CF0I, III, IV subunits
Photosystem I A1, A2, 9-kDa protein
Photosystem II D1, 51 kDa, 44 kDa, D2, Cytb559-9kDa
Photosystem II Cytb559-4kDa, G, 10Pi, I proteins
Electron transport Cytf, Cytb6, IV subunits
NADH dehydrogenase (ND) subunits 1, 2, 3, 4
NDL4L, 5
matK
clpP
cemA