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第二部分
研究型综合实验
实验目的
• 研究麦芽糖结合蛋白（Maltose
binding protein, MBP)免疫调节作用
• MBP 抗肿瘤作用及机制
MBP 免疫
Lewis 肺癌
细胞接种
小 鼠
测肿瘤大小
取脾制备淋巴细胞悬液
淋巴细胞分离
流式细胞术
ELISPOT
实 验 结 果 分 析、论 文 书 写
材 料 的 准 备
按照每组 8 只准备：
• 小鼠：免疫前两天（11月30日）领 C57BL/6（20 g左右）
雌性小鼠 50 只。
• 10 只 1 ml注射器，10 只灭菌的玻璃小试管。
• PBS（磷酸盐缓冲液）30 ml。
• MBP 2.4 mg 通过 Amylose 亲和层析纯化。
• BCG 50 mg/只 两支。
免疫方法：
MBP：50μg/只，BCG：3 mg/只，每隔 7 天免疫一
次，第二次免疫不加 BCG。鼠颈背部六点，腹股沟二点
皮下注射，每只鼠液体总量 400μl。
免疫日期：11月2日第一次，11月9日第二次。
小鼠免疫
PBS
Group 1 Group 2 Group 3 Group 4
Group 5
PBS+MBP
Group 6
Group 7
肿瘤接种
• 细胞培养：复苏 Leiws 肺癌细胞，用IMDM 液洗两次后，
在含 10% 新生牛血清，100 U/ml 青霉素，100 U/ml
链霉素的 IMDM 培养液，5% CO2 孵箱 37℃ 培养，收
集 4.5 x 107个细胞。
• 接种肿瘤细胞：20 只 C57 小鼠背部皮下注射生理盐水，
21 只注射 Leiws 肺癌细胞，2 x 106/只，观察肿瘤生
长情况。
• 接种时间：在第二次免疫后3天注射肿瘤细胞。
实验组及编号
• Group1：MBP(-) BCG (-) Tumor(-):
编号 G1-1, G1-2, G1-3, G1-4，G1-5，G1-6
• Group2：MBP(-) BCG(+):
编号 G2-1, G2-2, G2-3, G2-4，G2-5，G2-6
• Group3：MBP(+) BCG(-):
编号 G3-1, G3-2, G3-3, G3-4，G3-5，G3-6
• Group4：MBP(+) 50μg/只 BCG(+):
编号 G4-1, G4-2, G4-3，G4-4，G4-5，G4-6
• Group5：MBP(-) BCG (-) Tumor(+):
编号 G5-1, G5-2, G5-3,G5-4，G5-5，G5-6
• Group6：MBP(-) BCG(+) Tumor(+):
编号 G6-1，G6-2, G6-3, G6-4，G6-5，G6-6
• Group7：MBP(+) 50μg/只 BCG(+) Tumor(+):
编号 G7-1, G7-2, G7-3, G7-4，G7-5，G7-6
学生分组与安排
实验共分 7 个组，每组 6 人，每人一只鼠。
前 3 号做 ELISPOT，在超净台内操作
后 3 号做流式细胞术并检测，在超净台外操作
1-4 组在 211 室
5-7 组在 214 室，作流式的同学细胞加封闭液固定后，回
211室。
• 5-7 组每组杀完鼠后，分别集中放在 3 个塑料袋中收回。
• ELISPOT 操作步骤贴在超净台上。
• 流式细胞术操作步骤看幻灯。
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酶联免疫斑点试验,Enzyme-linked
immunospot assay,ELISPOT
实验目的
• 通过检测分泌 IFN-γ 的抗原特异性 T 细胞频数，
确定抗原特异性 Th1 细胞的活化。
实验原理
• 最灵敏、最有效的直接离体检测抗原特异
性 T 和 B 细胞的方法。
• 可用于检测特异性抗体分泌细胞和细胞因
子分泌细胞。
实验材料 1 —— 共用试剂与器材
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MBP 0.7 mg/ml,40μl：配成 50 μg/ml
RPMI1640 50 ml
ConA 50 μg/ml 200μl
细胞计数液 (3%醋酸溶液）100 ml
小鼠：实验当天从动物室取回
微量移液器 20μl，微量移液器
高压灭菌吸水纸 1 盒
细胞计数板 14 块，每组两块
游标卡尺 1 个
废液缸1个
超净工作台 6 个
CO2细胞培养箱
注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械枪尖及试剂均须高压。
实验材料 2
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—— 每个超净台内的试剂与器材：1-4 组
（211 三个超净台）
10% FCS + RPMI1640 50 ml X 1
PBS 50 ml X 1
淋巴细胞分层液 3 ml， 1 ml/管分装入 8 支玻璃试管中。
平皿 2 个，每个人半个。
4 个镊子，2 把剪刀，放入酒精烧杯装好。
200 目钢网 4 个，
5 ml 刻度吸管 2 只
毛细管 4 只
20μl、 200μl、1000μl 加样器各两把
20μl、 200μl、1000μl 加样器头各 1 盒
1.5 ml EP 管 一盒
记号笔 1支、废液缸 1 个、酒精棉球1 盒
• 大小胶帽各两个
注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械枪尖及试剂均须高压。
实验材料 2
—— 每个超净台内的试剂与器材：5-7 组
（214，2 个超净台）
• 10% FCS + RPMI1640 50 ml X 1
• PBS 50 ml X 1
• 淋巴细胞分层液 5 ml， 1 ml/管分装入 5支玻璃试管中。
平皿 3 个，每个人半个。
• 4 个镊子，2 把剪刀
• 200 目钢网 6 个，
• 5 ml 刻度吸管 2只，
• 20μl、200μl、1000μl 加样器各两把
• 20μl 、200μl、1000μl加样器头各 1 盒
• 1.5 ml EP 管 一盒
• 记号笔 2 支、废液缸 1 个、酒精棉球1 盒
• 大小胶帽各两个
注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械枪尖及试剂均须高压。
进入超净台安排（房间 211）
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一组 6 个人同时操作。需要 3位教师指导
首先平皿、试管做标记（写好编号）
将两组共用器材放在中间（枪尖盒、剪刀镊子）
磨脾取出细胞后，将平皿排列整齐放在右侧
第一组、第二组进入取脾后细胞离心（第一轮，20分钟）
第三组、四组进入继续（第二轮，20分钟）
第一组、第二组洗细胞1次（第三轮， 10分钟）
第三组、四组洗细胞1次（第四轮，10分钟）
第一组、第二组洗细胞1次（第五轮， 10分钟）
第三组、四组洗细胞1次（第六轮10分钟）
进入超净台安排（房间 214）
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一组 4 个人同时操作。需要 2 位教师指导
首先平皿、试管做标记（写好编号）
将两组共用器材放在中间（枪尖盒、剪刀镊子）
磨脾取出细胞后，将平皿排列整齐放在右侧
第五组、第六组1个人进入取脾（第一轮，20分钟）
第六组2个人、第 7 组2个人进入继续（第二轮，20分钟）
第七组1个人取脾、第五组洗涤1次（第三轮， 10分钟）
第六组、第 7 组1个人洗细胞1次（第四轮10分钟）
第 7 组 2 个人洗细胞1次、第五组 2 人洗细胞2次（第五轮，
10分钟）
• 第六组、第 7 组2个人洗细胞2次（第六轮10分钟）
• 第 7 组1个人洗细胞2次（第七轮10分钟）
一、小鼠脾脏淋巴细胞分离
密度梯度离心法原理
利用血液中各种细胞的比重不同，红细胞和多核系
白细胞比重 1.092，单个核细胞为1.070，因此将抗凝
血置于比重为 1.077 左右的分层液上，经过一定速度
和时间的离心沉淀，即可分离出较纯的单个核细胞。淋
巴细胞占 90% 以上。
根据比重不同进行分离
淋巴细胞分离操作步骤
1、处死小鼠，进入超净台。
2、将装好 1 ml 淋巴细胞分层液的玻璃试管编号，取 3 ml RMPI1640 培
养液放入平皿中，放入钢网。
3、取脾脏放在钢网上研磨，摇动平皿，使细胞充分进入液体中，制备细胞
悬液。
4、然后用 1 ml 加样器取 2 ml 脾细胞悬液轻轻置于分层液上。
5、1800 转，室温离心 15 分钟。
6、用毛细管吸上清弃去，尽量吸取毛玻璃层，放入 1.5 ml EP 管。
7、用 1 ml 加样器加入 PBS 1 ml 悬浮细胞，1500 rpm 离心 5 分钟.
8、在超净台中用 1 ml 枪尖吸取上清弃去，再加入 PBS 1 ml 1500 rpm
离心 5 分钟，弃去上清。
9、用 1 ml 加样器加入 1 ml 培养液悬浮细胞，用 200μl 加样器取 50
μl 加入另一 EP 管中，细胞计数。
10、调细胞浓度 3 x 10 6/ml 制备 1 ml 细胞悬液备用。
二、接种细胞
操作步骤
1、预包被板活化：加入 200μl 的 RPMI 1640 培养基,室温
静置 10 min，倾倒。（由教师完成）
2、加细胞：每孔加入 3 x 105 个细胞，100μl/well。
设一组正对照（ConA），每孔加入 50μg/ml Con A 10μl。
每一个细胞样品（同一个实验动物）要设一个负对照（不加
刺激物），一个MBP刺激组，50μg/ml MBP 10μl（终浓度
5μg/ml），整块板设一个背景负对照（不含细胞，只加培养
基和所有的检测试剂）。
按照图示加细胞（由教员完成）。
3、细胞培养：盖上板盖，放入37℃，5% CO2培养箱培养 24 h.
1
2
5
6
7
8
9
10
A
背景
G1-1
G1-2
G1-3
G2-1
G2-2
G2-3
G3-1
G3-2
G3-3
B
G1-1
G1-1
G1-1
G1-1
G1-2
G1-2
G1-2
G1-2
G1-3
C
G2-1
G2-1
G2-1
G2-1
G2-2
G2-2
G2-1
G2-2
D
G3-1
G3-1
G3-1
G3-1
G3-2
G3-2
G3-2
E
G4-1
G4-1
G4-1
G4-1
G4-2
G4-2
F
G5-1
G5-1
G5-1
G5-1
G5-2
G
G6-1
G6-1
G6-1
G6-1
H
G7-1
G7-1
G7-1
2.5
5
Ag
0
（μg）
3
4
11
12
G1-3
G1-3
G1-3
Group1
G2-3
G2-3
G2-3
G2-3
Group2
G3-2
G3-3
G3-3
G3-3
G3-3
Group3
G4-2
G4-2
G4-3
G4-3
G4-3
G4-3
Group4
G5-2
G5-2
G5-2
G5-3
G5-3
G5-3
G5-3
G6-2
G6-2
G6-2
G6-2
G6-3
G6-3
G6-3
G6-3
G7-1
G7-2
G7-2
G7-2
G7-2
G7-3
G7-3
G7-3
G7-3
10
0
2.5
5
10
0
2.5
5
10
只加细胞不加抗原
ConA +
Group5
Group6
Group7
第二天：按照说明书操作
（不再需要无菌操作）
试剂与器材
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IFN-γ预包被试剂盒：
Biotinylate antibody（生物素标记抗体100μl
Streptavidin-HRP（酶联亲和素）100μl
Dilution buffer R (1 X) 10 ml X 2,
Washing buffer(50 X)10 ml（实验员配制）
AEC 稀释液 10 ml, AEC solutionⅠ500μl, AEC solutionⅡ 500 μl,
AEC solution III 50μl
IFN-γ预包被96孔板一块
200μl、1000μl加样器各1 把
200μl加样器头 20个
蒸馏水 250 ml X 4（高压），4度保存备用
5 ml 玻璃试管 1 支
37度 5%CO2 孵箱
吸水纸1盒
试剂配制
• Biotinylate antibody（生物素标记抗体）：
100 μl+ Dilution buffer R 10 ml
• Streptavidin-HRP（酶联亲和素）：
100 μl+ Dilution buffer R 10 ml
• Dilution buffer R (1 X): 10 ml ( 2 只）
• Washing buffer (50 X)：10 ml + 蒸馏水 500 ml
• AEC 显色液：10 ml （临用时配制）
AEC稀释液
9 ml
AEC solution Ⅰ AEC solutionⅡ
500 μl
500 μl
AEC solutionⅢ
50 μl
4、裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基。每孔加入 200μl 冰
冷的去离子水，4℃ 冰箱冰浴10分钟（低渗法裂解细胞）。
5、洗板：每孔用 200μl 1× Washing buffer 洗涤 7次，每
次 30 秒，并在吸水纸上扣干。
6、检测抗体孵育：每孔加入100 ul稀释好的生物素标记抗体，
37℃孵育1 h.
7、洗板：每孔用 200μl 1× Washing buffer 洗涤 5次，每
次 30 秒，并在吸水之上扣干。
8、亲和素孵育：每孔加入100 μl 稀释好的酶标亲和素，37℃
孵育 1 h.
9、洗板：每孔用 200 μl 1× Washing buffer 洗涤 5次，
每次 30 秒，并在吸水纸上扣干。
10、显色：每孔加入100 μl的显色液，室温避光静置 15-45
分钟（在 20-25℃，显色 25 min 比较合适）。
11、终止：待斑点长到合适的大小之后，以去离子水洗涤 2
遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水
珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置 10-30
min，让膜自然晾干。
12、肉眼观察。
流式细胞术（Flow cytometry)
实验目的
• 检测小鼠脾淋巴细胞 CD4+ CD8+ 细胞亚群。
实验原理
• 采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学、电学及计算机分
析而产生的鉴定和分离细胞亚群的技术。
又名荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter, FACS).
基本运作程序
1、细胞与激光束相交而产生光信号
2、光信号转化成电信号
3、光信号数字化，计算机处理
Side scatter
Histogram 直方图
Dot blot 散点图
Forward scatter
每组的试剂与器材：1-4 组 （211）
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平皿 2 个，每个人半个。
4 个镊子，2 把剪刀，放入酒精烧杯装好。
200 目钢网 4 个，
毛细管 4 只
20μl、200μl、1000μl 加样器各两把
20μl 、200μl、1000μl 加样器头各 1 盒
1.5 ml EP 管 一盒
记号笔 2支、废液缸 1 个、酒精棉球1 盒
淋巴细胞分层液 3 ml， 1 ml/管分装入 3 支玻璃试管中。
10% FCS + RPMI1640 50 ml X 1
PBS 50 ml X X 1
2% 多聚甲醛 3 ml
FACS 液 30 ml
玻璃试管 6 支，吸水纸若干
注：流式所用的玻璃器皿、器械枪尖及试剂均须高压。
每组的试剂与器材：5-7 组（214）
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平皿 3 个，每个人半个
4 个镊子，2 把剪刀
200 目钢网 6 个，
5 ml 刻度吸管 5 只，吸球 2 个
淋巴细胞分层液 5 ml， 1 ml/管分装入 5支玻璃试管中
20μl、 200μl、1000μl 加样器各两把
20μl、 200μl、1000μl加样器头各 1 盒
1.5 ml EP 管 一盒
记号笔 2 支、废液缸 1 个、酒精棉球1 盒
10% FCS + RPMI1640 50 ml X 1
PBS 50 ml X 1
2% 多聚甲醛 3 ml
FACS 液 50 ml
玻璃试管 6支
带盖冰盒 1 个，试管架 1 个，吸水纸若干
注：流式所用的玻璃器皿、器械枪尖及试剂均须高压。
共用试剂器材
FITC-抗 CD4 20 μl
FITC-抗 CD8 20 μl
PE-抗 CD3 40μl
10 ml玻璃试管 4 支
EP 管 4 个
10 uL\ 200 uL 加样器各1把
10 uL\ 200 uL 加样器头各1盒
离心机1台
漩涡搅拌器1台
流式细胞仪1台
注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械枪尖及试剂均须高压。
试剂配制
2% 多聚甲醛 50 ml：1g多聚甲醛加入 50 ml PBS 中，
4℃ 保存。用时稀释 至0.5%。
FACS液（含 2 % 胎牛血清+ 0.1 % 叠蛋钠的 PBS）
250 ml 胎牛血清 5 ml ，叠蛋钠 0.25 g 溶于 250 ml
PBS 中，4℃ 保存。
实验分组
• 7 个组中每组4、 5、6号在超净台外做。
• 每人 2 支玻璃试管,一支做 CD4 管，另一支做 CD8 管。
在每只试管上标记编号,如 G1-4 CD4,G1-4 CD8.
• 4 只试管，标好空白、CD3,CD4,CD8用于机器调试。
实验方法
1、处死小鼠。
2、将装好 1 ml 淋巴细胞分层液的玻璃试管编号，取 3 ml RMPI1640 培养
液放入平皿中，放入钢网。
3、取脾脏放在钢网上研磨，摇动平皿，使细胞充分进入液体中，制备细胞
悬液。
4、然后用 1 ml 加样器取 2 ml 脾细胞悬液轻轻置于分层液上。
5、1800 转，室温离心 15 分钟。
6、用毛细管吸上清弃去，尽量吸取毛玻璃层，放入 1.5 ml EP 管。
7、用 1 ml 加样器加入 PBS 1 ml 悬浮细胞，1500 rpm 离心 5 分钟.
8、用 1 ml 枪尖吸取上清弃去，再加入 PBS 1 ml 悬浮细胞，取 50 μl 加入
另一 EP 管中，细胞计数。
9、其中1只正常组小鼠需要 2 X 106个，每管 5 X 105 （4个对照组由教师
完成），其余每只取 1 X 106 分成两管，每管 5 X 105 个加入玻璃试
管中。做好标记。
10、加入 PBS 1 ml 洗1次，1500 rpm，5 min。离心洗涤一次，弃上清。
用漩涡搅拌器悬浮细胞，置于冰上。
荧光抗体
No1
No2
No3
No4
No 5
No 6-21
CD3-PE
-
1 μl
-
-
1 μl 1 μl 1 μl 1 μl
CD8-FITC
-
-
1 μl
-
1 μl
-
1 μl
-
CD4-FITC
-
-
-
1 μl
-
1 μl
-
1 μl
12、加入用 冰冷的 FACS 液 1 ml 4℃ 封闭 1 h。
13、按表加样，混悬细胞，置冰盒中避光反应 30 min，每 15 min 混匀
一次。
14、1500 rpm，5 min，用 FACS 液 1 ml 洗细胞二次，1500 rpm，
5 min。
15、每管加入 2% 多聚甲醛 150 μl，FACS液 450 μl，待检。
16、病理实验室流式细胞仪检测。
荧光抗体配制
1
FACS 液
387μl
CD3 抗 体
43μl
CD4 抗 体
CD8 抗 体
2
3
178μl
178μl
22μl
22μl