Transcript Mikroskop i mikroskopiranje

Mikroskop i
mikroskopiranje
Mikroskop
•
•
opticki instrument za posmatranje objekata
manjih od 0,1mm (nevidljivih golim okom)
Osnovni tipovi mikroskopa:
1.
2.
3.
4.
5.
svetlosni mikroskop (mikroskop sa svetlim poljem)
mikroskop sa tamnim poljem
mikroskop sa faznim kontrastom
fluorescentni mikroskop
elektronski mikroskop
Svetlosni mikroskop
•
•
Uveličanje lika objekta do 2000x
radi na principu propustanja svetlosnog
snopa
• Osnovni delovi mikroskopa:
1. mehanički: postolje, stativ sa ručicom,
tubus, revolverski uredjaj, stočic, nosač
uredjaja za osvetljenje i zavrtnji
(makrometarski, mikrometarski i
kondenzorski)
2. optički: izvor svetla, kondenzorsko sočivo,
objektiv, okular, dijafragma
Svetlosni mikroskop
Mehanički delovi mikroskopa
• Postolje - deo na kojem stoji mikroskop i na koji se
nastavlja stativ
• Stativ - srednji deo naziva se ručica (prihvatanje i
prenošenje mikroskopa), na bočnoj strani su
makrometarski i mikrometarski zavrtnji (fokusiranje
objekta)
• Makrometarski zavrtanj - grublje fokusiranje
(pronalaženje lika)
• Mikrometarski zavrtanj - izostravanje detalja lika
• Tubus - nastavlja se na gornji deo stativa, na gornjem
delu tubusa okular, a na donjem revolverski uredjaj sa
objektivima
Mehanički delovi mikroskopa
• Stočic – površina na koju se stavlja predmetnica,
odnosno objekat posmatranja, sadrži centralni otvor
kroz koji prolazi svetlosni snop iz kondenzora i
osvetljava uzorak, ležište za predmetnicu (bočni
fiksirani graničnik i opruga)
Optički delovi mikroskopa
• Kondenzorsko socivo – smešteno ispod stočića,
podizanjem i spuštanjem koje se ostvaruje bočno
postavljenim zavrtnjem reguliše se intenzitet svetla kojim
se prosvetljava objekat, dodatni delovi blenda i filter
• Objektivska sočiva – sistem uzajamno centriranih sočiva
smeštenih u metalnu cev
• frontalno sočivo (najblize preparatu), sva ostala
• korekciona (odstranjivanje nedostataka koji nastaju
prilikom stvaranja lika)
• razlikuju se po moci uvećanja (odnos izmedju
stvarne i prividne veličine objekta) i
• moći razdvajanja (najmanje rastojanje izmedju 2
tačke koje se razlikuju kao odvojeni objekat)
Optički delovi mikroskopa
• Objektivska sociva
•suva – izmedju frontalnog sočiva i objekta koji se
posmatra je vazduh, manja uvećanja (10x, 40x)
•imerziona – izmedju frontalnog sočiva i preparata
imerziono ulje (ne dolazi do prelamanja svetlost,
indeks prelamanja sličan indeksu prelamanja stakla)
• Okulari – smešteni na gornjem delu tubusa
• sastoje se od 2 sociva, sabirnog – donje, okrenuto
prema objektu
• očnog sočiva – gornje, okrenuto prema oku
posmatrača
Optički delovi mikroskopa
imerziona objektivska
sociva – izmedju
frontalnog sočiva i
preparata imerziono
ulje (ne dolazi do
prelamanja svetlost,
indeks prelamanja
sličan indeksu
prelamanja stakla
Lik posmatranog objekta
• lik koji obrazuje objektiv – uvećan, stvaran, izvrnut u
odnosu na posmatrani objekat; ne posmatra se
direktno, već posredstvom okulara koji funkcioniše
kao lupa
• lik koji obrazuje okular – imaginaran, uvećan
• ukupno uvećanje mikroskopa jednako je proizvodu
uvećanja objektiva i okulara
The light patway of a microscope
Mikroskopiranje
1. Fiksirani, bojeni preparati
• lik se nadje na malom uvećanju
• na preparat se nanosi kap imerzionog ulja,
mikroskopira se imerzionim objektivom
• kondenzor se dovodi u gornji položaj (maksimalni
intenzitet svetlosti), lik se dobija pažljivim
okretanjem mikrometarskog zavrtnja
2. Nativni preparati
• postupak mikroskopiranja potpuno isti kao kod
bojenih preparata, s tom razlikom što se kondenzor
udanjava od predmetnice (smanjuje se intenzitet
svetlosti, kako bi se videli transparentni mo)
Mikroskop sa tamnim poljem
• objekat osvetljen kosim zracima, svetlost ne dolazi do
objektiva
• do oka dopire prelomljena svetlost sa objekta
• objekti su svetli u tamnom vidnom polju
• primena specijalnog kondenzora sa zatamnjenim
centralnim delom (svetlosni zraci ne osvetnjavaju
objektiv)
• posmatranje sitnih transparentnih mo, koji su van
moći razdvajanja svetlosnog mikroskopa
Mikroskop sa tamnim poljem
primena specijalnog
kondenzora sa
zatamnjenim centralnim
delom
Mikroskop sa tamnim poljem
Mikroskop sa tamnim poljem
posebno korisna
tehnika kada je u
pitanju
posmatranje
spiroheta
Mikroskop sa faznim kontrastom
• Zernikeov mikroskop
• posmatranje živih, neobojenih mo i njihovih organela
• na bojenim preparatima moguće uočiti organele, ali mo
nisu živi
• princip mikroskopiranja zasnovan na osobini ćelija da
imaju različit indeks prelamanja svetlosti od okolne
sredine
• amplitudni objekti-tamni, amplituda (intenzitet)
svetlosnog zraka redukovana prilikom njegovog
prolaska kroz objekat (difrakovani zraci)
• fazni objekti-transparentni, prilikom prolaska
svetlosnog zraka kroz objekat ne dolazi do promene
amplitude i faze (direktni zraci)
Amplitudni i fazni objekti
Mikroskop sa faznim kontrastom
• kondenzator sa prstenastom dijafragmom
pozicioniranom izmedju izvora svetlosti i sočiva
kondenzatora
• svetlost prolazi kroz prstenasti otvor dijafragme,
krug svetlosti prolazi kroz kondenzor i objekat i
dolazi u objektiv
• objektiv ima fazni prsten (menja fazu svetlosti
za 1/4 λ)
• svetlost koja prolazi kroz ćeliju prelazi duži put
(veći indeks prelamanja), stiže u okular u
različitoj fazi prema zraku koji ne prolazi kroz
objekat, interferencija daje lik
Razlika izmedju preparata posmatranog svetlosnim
i mikroskopom sa faznim kontrastom
Fluorescentni mikroskop
• kao izvor svetlosti koriste se živine lampe
• kondenzor sa tamnim poljem
• tri seta filtera kroz koje prolazi svetlost pre nego što
stigne do oka
• molekul posmatranog objekta apsorbuje energiju
elektromagnetnog talasa (svetlosni zrak), dolazi do
njegove ekscitacije, emisijom svetlosti molekul se
vraća u prvobitno nepobudjeno stanje, a pojava se
naziva florescencija
• tehnika podrazumeva primenu florohroma, supstanci
kojima se tretiraju objekti, kako bi postojala
mogućnost florescencije
Fluorescentni mikroskop
Elektronski mikroskop
•
•
•
•
•
1.
2.
umesto svetlosnih zraka primenjuje se snop
elektrona
moć razdvajanja nije ograničena λ (10000 puta
kraća nego u slučaju zraka svetlosti)
umesto sistema sočiva koristi se sistem
elektromagneta
neophodan je sistem za održavanje vakuuma u kome
se elektronski zrak kreće
Osnovni tipovi el. mikroskopa:
skening elektronski-3D slika, pretražujući, manje
uvećanje, elektroni se odbijaju od objekta
transmisioni-2D slika, e¯ prolaze kroz objekat
Skening elektronski mikroskop
Transmisioni elektronski
mikroskop
Merenje
dimenzije
posmatranog
objekta
Merenje dimenzije posmatranog objekta
okular-mikrometar
objektiv-miktometar
Merenje
dimenzije
posmatranog
objekta