Transcript Break dosage, cell cycle stage and DNA M

BREAK DOSAGE, CELL CYCLE STAGE AND DNA REPLICATION
INFLUENCE DNA DOUBLE STRAND BREAK (DSB) RESPONSE.
CHRISTIAN ZIERHUT1 AND JOHN FX DIFFLEY
Presenta
Elizabeth Sosa Castillo
MECANISMOS QUE EVITAN LA RUPTURA DE LOS CROMOSOMAS
 Unión no homóloga de extremos (NHEJ)
 “Los extremos rotos se yuxtaponen y se ligan”
 Generalmente supone la pérdida de uno o varios nucleótidos en el
sitio de unión
 Unión homóloga de extremos (HR)
 Se utiliza un mecanismo relacionado con los procesos de
recombinación de DNA.
 Se utiliza el otro cromosoma para reparar sin pérdida de
nucleótidos
 Resección: ruptura de la cadena de ADN con degradación
nucleolitica en el extremo 5´.
 Etapa ciclo celular
Cinasa dependiente
de ciclina (CDK)
Elección entre
NHEJ y HR
Actividad CDK--- NHEJ (Fase G1)
Actividad CDK--- HR
OBJETIVO
 Describir un análisis cuantitativo del procesamiento de
DSB en Saccharomyces cerevisiae.
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL SSDNA
*Discriminar eficientemente
entre ssDNA y dsDNA
(cuantificación precisa)
*Resistencia de ssDNA a la
digestión por BstUI
ANÁLISIS DEL PROCESAMIENTO DE DSB Y ACTIVACIÓN DEL PUNTO DE
CONTROL (CHECKPOINT)
Investigar correlación entre la resección DBS y la activación checkpoint
Ddc2 – Proteína requerida para la respuesta de la activación del
checkpoint, se ha localizado en sitios específicos de daño al
DNA.
Reparación
DNA
1
ANÁLISIS DEL PROCESAMIENTO DE DSB Y ACTIVACIÓN DEL PUNTO DE
CONTROL (CHECKPOINT)
Activación Rad53 en
células arrestadas en
fase G2/M, pero no en
fase G1.
Ensayo de Inmunoblot
2
LA ACTIVACION DEL CHECKPOINT Y LA RESECCIÓN DE DBS
SON PROCESOS DEPENDIENTES DE LA DOSIS DE RUPTURA
Investigar el efecto de dosis DBS (número
rupturas) sobre la respuesta DSB
LA RESECCIÓN DE DSB ES REGULADA POR MECANISMOS
DEPENDIENTES E INDEPENDIENTES DE NHEJ EN FASE G1
Investigar la posibilidad de
que la resección en fase G1
es prevenida por NHEJ.
3
EL PROCESAMIENTO DE DSB REQUIERE DEL LA REPLICACIÓN DEL ADN
LA ACTIVACION DEL CHECKPOINT REQUIERE DE LA REPLICACION DEL ADN
EL INCREMENTO DE LA ACTIVACIÓN DEL CHECKPOINT POR DSBS
DURANTE LA REPLICACIÓN ES DEPENDIENTE DE RAD9 PERO NO
DE MRC1
CONCLUSIONES
 Identificaron cuatro factores que influyen en las DSBs:
NHEJ, etapa del ciclo celular, dosis de DSB y presencia de
horquillas de replicación de ADN.
 Dos características del procesamiento de DBS son reguladas
durante el ciclo celular:
 a)Un elevado NHEJ durante la fase G1 previene el inicio de la
resección del DNA.
 b)mecanismo independiente
de NHEJ previene una
resección extensa durante la fase G1.
 La activación del checkpoint es dependiente de la
replicación (Rad9).