Transcript 荧光探针法测定蛋白质含量

荧光探针法测定
蛋白质含量
问题思考：
1.什么是荧光？
2.什么是蛋白质
的荧光探针？
蛋白质的荧光探针
是一类比蛋白质
荧光发射更强的荧光
染料，它吸附或共价
结合在蛋白质上，使
蛋白质的荧光特性发
生变化，从而可以研
究蛋白质的结构和测
定蛋白质。
本实验采用长链水溶性
磺酸吲哚探针——二聚
体吲哚类探针I作为血清
蛋白的生物荧光染料，
为血清蛋白的测定建立
了一种简便，灵敏、稳
定的新型荧光探针检测
分析体系。
实验原理
如图，当pH=2．50，吲哚探针I的荧光激发
波长为548 nm，发射波长为562 nm(图1曲线
1)，stokes位移14 nm。加入牛血清蛋白BSA
后，荧光强度明显增强，发射波长发生红
移。
 在酸性条件下，血清蛋白分子带正电，吲哚
探针I带有多个负电荷磺酸基团，探针I可以通过
电荷吸引接触蛋白分子，并与蛋白质分子中的氨
基、羧基及巯基等基团形成氢键，结合在蛋白质
分子上，使得探针周围微环境非极性增强，探针
受水分子作用而导致的荧光能量损失现象得到有
效抑制，体系荧光得到增强
如图1所示，随着BSA浓度的增加，荧光强度逐渐
增大(曲线2～8)，荧光波长明显红移
 同时，随着蛋白质浓度的增加，蛋白质a螺
旋结构逐渐转为折迭态，a螺旋结构紧密程
度增加，嵌入结合在蛋白分子内部的探针
自由扭动现象受阻，探针能量传递效率增
大，体系荧光强度逐渐增大
实验仪器
 Car,／Eclipse荧光光度计(Varian，USA）
 FA1104N电子天平(上海)
 PHS一3C型精密酸度计(上海)
实验试剂
 牛血清蛋白(BSA)以水配制成浓度为1．00
ms／ml的贮备液
 吲哚类探针I(实验室合成)，以水配制成浓
度为3．0×10一mol／L的贮备液
 柠檬酸钠一HC1缓冲液(pH=2．50)
实验方法
 在10 mL的容量瓶中依次加入3．0×10-5
mol／L吲哚探针溶液1．0 mL，柠檬酸钠HC1缓冲溶液2．0 mL
 混匀后，加入适量的50．0 t~g／mL牛血清
蛋白溶液，稀释至刻度，静置5 min。
 在荧光光度计上测定荧光增强值△I=I－Io
实验条件的选择与优化
PH 的 选 择
pH影响
当pH为1．10～2．50时，BSA-探针体系的
荧光强度随pH增加而增强。
当pH 2．50时，BSA-探针体系的荧光强度
最大；
当pH2．70～4．00时，蛋白分子正电荷随
着体系酸度下降而降低，不利于探针外层
带有负电荷的磺酸离子与蛋白质分子接触，
BSA与探针结合作用减弱，荧光增强程度降
低。
探针浓度的选择
探针浓度影响
 实验表明，当探针浓度为3.0umol/L时，
n(探针)：n(BSA)=40:1荧光背景强度适宜，
体系荧光增强最为明亮
 当探针浓度大于3．0 umol／L时，BSA与探
针作用趋向饱和，但随着探针浓度的上升，
游离的荧光探针浓度增大，荧光背景值增
强，BSA一探针有效吸收激发光的几率降低，
体系荧光增强程度降低
NaCl 浓度的选择
NaC1离子强度的影响
 随着NaC1浓度增大，离子强度增大，蛋白
分子结构形态可能产生部分改变，与染料
的结合能力下降，体系荧光强度快速下降；
 当NaC1浓度大于0．125mol／L，离子强度
较大，较低浓度的蛋白分子a螺旋结构可能
从紧密折迭态完全转变为展开状态，与探
针嵌入作用较低，体系荧光强度趋向稳定。
实验评价
本实验灵敏度高、操作简便且BSA-探针体
系荧光强度增大值与BSA质量浓度呈良好
线性关系，线性范围宽（0．80～25．00
ug／mL），检出限低（0．05g／mL）
但对仪器的精密度要求较高，所用仪器价格
昂贵