Transcript Geen diatitel

RFLP
Restrictiefragmentlengte polymorfisme
J. Smeets - A. Leen
Principe
DNA
CGGAGGTGCGCATACTGACCGCGGTATACTAG
GCCTCCACGCGTATGACTGGCGCCATATGATC
Restrictie-enzym zal DNA verknippen
8 basenparen
21 basenparen
5 basenparen
CGTATACT CGACCGCGGTATACTAGTCCT CGGAG
GCATATGA GCTGGCGCCATATGATCAGGA GCCTC
In dit geval ontstaan er 3 DNA-fragmenten met
Een enzym
bijvoorbeeld
het DNA
verschillende lengte,
duszal
met
een verschillend
verknippen
in het
middenkan
van de
aantal basenparen.
In de
praktijk
hetsequentie
aantal
CG hoog zijn,
basenparen in 1 fragmentCTzeer
GA GC
bijvoorbeeld 15 630 basenparen (bp).
Elektroforese
Referentiestaal met gekende DNA-fragmenten van
bijvoorbeeld 10, 20 en 30 basenparen.
Ons DNA-staal
Negatief geladen Kleurstof
Elektroforese
- - - - - pool - - - - Ons DNA-staal
+ kleurstof
Referentiestaal
+ kleurstof
Kleurstof is negatief geladen en zal naar de positieve pool
migreren. Alzo kan men op zicht het proces volgen.
De DNA-fragmenten (die ook negatief geladen zijn) zullen ook
migreren, maar deze fragmenten kunnen we niet zien!
+ + + + + pool + + + + +
DNARESULTAAT
zichtbaar maken
Ons DNA-staal
Referentiestaal
30 basenparen
21? basenparen
8 ? basenparen
20 basenparen
DNA wordt
10 basenparen
zichtbaar
5 ? basenparen
onder UVlicht
Alzo kan men a.h.v. het referentiestaal het aantal
basenparen van onze DNA-fragmenten schatten.
Toepassing 1: CRIMINOLOGIE
Verdachte A
B
C
DNA
(vb. in bloed)
aangetroffen
op
slachtoffer
Alzo kan men patronen vergelijken en conclusies
trekken. Voorzichtigheid is geboden!
Toepassing 2: ERFELIJKE ZIEKTEN OPSPOREN
Gezond persoon
Persoon met ziekte
Alzo kan men patronen vergelijken en hiermee
bijvoorbeeld stofwisselingsziekten opsporen.
Toepassing 3: dier- of plantensoorten vergelijken
Soort A
400 bp
300 bp
240 bp
200 bp
10 bp
Soort B
Soort C
600 bp
600 bp
basensubstitutie
300 bp Deletie
280 bp
240 bp
240 bp
10 bp
10 bp
Men vergelijkt soorten op erfelijke basis.
Doel: mutaties zoeken en evolutielijnen opstellen.
Aansluitend practicum.
Vliebergh Sencie 1999
Mutaties zoeken
Werken met papieren DNA-modellen.
Een schaar gebruiken als restrictie-enzyme.
Mogelijke verklaringen geven voor deze mutaties:
deletie, insertie, substitutie (inversie).
DNA-monsters worden behandeld met een bepaald
enzym: restrictie-endonuclease.
Hiervan zijn er nu al meer dan honderd
verschillende bekend. Elk enzym herkent een
welbepaalde opeenvolging van 4 tot 5 basen in het
DNA en zal het DNA telkens ter hoogte van een
dergelijke sequentie “doorknippen”. Daarom
worden ze ook wel knipenzymen genoemd.
Zo ontstaat voor elk behandeld DNA-monster een
verzameling van fragmenten met verschillende
lengte. Via elektroforese kan men dan deze
fragmenten van elkaar scheiden.
Als er wijzigingen optreden (mutaties) in het DNA, zal de
basenvolgorde anders zijn en kunnen er, na gebruik van
restrictie-enzymen, fragmenten ontstaan die een andere
lengte hebben. Alzo zullen de elektroforesebeelden er
anders uitzien; er ontstaat een zogenoemd polymorfisme
(veelvormigheid). Vandaar de naam van de methode:
RESTRICTIEFRAGMENT-LENGTE POLYMORFISME.
Gedurende de evolutie van een soort ontstaan er in het
DNA mutaties, waardoor individuen ontstaan die genetisch
verschillend zijn. Voorbeelden van mutaties zijn o.a. de
omzetting van een base in een andere (basensubstitutie) of
het bijkomen (insertie) of verdwijnen (deletie) van één of
meerdere basen in het DNA.
Benodigdheden
•
lange papieren strook waarop in grote letters de
basenpaaropeenvolging van een kort dubbelstrengig DNAmolecule staat afgebeeld.
•
scharen (= ‘knipenzymen’).
•
blad papier.
Werkwijze
• leerlingen moeten zich als knipenzymen gedragen. Hiervoor overlopen zij
de DNA-streng van links naar rechts en knippen het dubbelstrengig DNAmolecuul in het midden van een bepaalde herkenningssequentie door.
Sommige leerlingen kunnen als knipenzym A functioneren, anderen als
enzym B. Beiden hebben een andere herkenningssequentie. Alle DNAmoleculen worden met beide enzymen bewerkt.
• op een blad papier kan men een XY-assenkruis tekenen. Op de Y-as
kunnen dan nummers (aantal basenparen) aangebracht worden,
overeenkomend met de lengte van de fragmenten. Op de X-as kunnen
bijvoorbeeld vier condities aangebracht worden (bv DNA I verknipt met
enzym A, DNA II verknipt men enzym A, DNA I verknipt met enzym B,
DNA II verknipt met enzym B)
• zoek mogelijke verklaringen voor de resultaten
• controleer je hypothesen (bv leg de fragmenten met 10 bp en 7 bp op de
juiste manier achter elkaar en vergelijk met fragment met 17 bp)
Aantal bp
Vergelijking DNA I en DNA II
30
20
26
26
23
21
23
21
17
10
23
18
20
18
13
12
10
8+8
10
7
5
22
13
10
8
4
0
DNA I
knipenzym A
DNA II
knipenzym A
DNA II
knipenzym B
DNA I
knipenzym B
Conclusie
• via vergelijking van de lengte van bepaalde
fragmenten kan men bepaalde soorten mutaties
als mogelijke oorzaken aangeven
• niet alle fragmenten met dezelfde lengte hebben
noodzakelijk dezelfde basenvolgorde
• fragmenten met dezelfde lengte bevinden zich op
eenzelfde plaats op het elektroforesebeeld