Transcript basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen

basistechnieken van de
recombinant-DNA-technologie
Deel 1
door Peter Roels
Monitoraat Wetenschappen
K.U. Leuven
basistechnieken van de
recombinant-DNA-technologie
•
•
•
•
•
•
•
DNA-dubbelhelix
inleiding: 3 pijlers
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
Southern-vlektechniek
genkloning
polymerase-kettingreactie
DNA-sequentiebepaling
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
basistechnieken van de
recombinant-DNA-technologie
•
•
•
•
•
•
•
DNA-dubbelhelix
inleiding: 3 pijlers
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
Southern-vlektechniek
genkloning
polymerase-kettingreactie
DNA-sequentiebepaling
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-dubbelhelix
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-dubbelhelix
5’ TGA 3’
3’ ACT 5’
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
basistechnieken van de
recombinant-DNA-technologie
•
•
•
•
•
•
•
DNA-dubbelhelix
inleiding: 3 pijlers
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
Southern-vlektechniek
genkloning
polymerase-kettingreactie
DNA-sequentiebepaling
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
3 pijlers in de
recombinant-DNA-technologie
• complementaire basenparing
• restrictie-enzym of restrictie-endonuclease
• DNA-polymerase
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
steeds:
adenine – thymine
(2 H-bruggen)
guanine – cytosine
(3 H-bruggen)
van groot belang in biologische werking, o.a.:
- DNA-replicatie
- RNA-synthese
cruciaal in vele technieken!
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
absorbantie
es DNA
DENATURATIE
ds DNA
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
temperatuur
complementaire basenparing
absorbantie
Ts
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
temperatuur
complementaire basenparing
absorbantie
GC-gehalte
Ts < Ts < Ts
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
temperatuur
complementaire basenparing
absorbantie
es DNA
RENATURATIE
ds DNA
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
temperatuur
complementaire basenparing
• ook tussen niet perfect complementaire
strengen is renaturatie (hybridisatie)
mogelijk
• algemene regel:
- smelttemperatuur van deze dubbelhelix
lager naarmate aantal complementaire basen
afneemt
- hoe meer de strengen complementair aan
elkaar, hoe hoger de temperatuur van het
medium vóór denaturatie
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
restrictie-enzymen
• herkent en knipt welbepaalde sequentie
van nucleotiden (4 tot 8 bp)
• herkenningssequentie is palindroom
5’...GAATTC...3’
3’...CTTAAG...5’
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
restrictie-enzymen
• herkent en knipt welbepaalde sequentie
van nucleotiden (4 tot 8 bp)
• herkenningssequentie is palindroom
• vaak met vorming “kleverige eindjes”
5’...GAATTC...3’
3’...CTTAAG...5’
Vliebergh 2004
...G
AATTC...
...CTTAA
G...
DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-polymerase
• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng
aan op enkelstrengse matrijs
• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start
• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan
3’-uiteinde
5’...GA
3’
3’...CTTAAG... 5’
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-polymerase
• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng
aan op enkelstrengse matrijs
• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start
• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan
3’-uiteinde
5’...GAATTC... 3’
3’...CTTAAG... 5’
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
basistechnieken van de
recombinant-DNA-technologie
•
•
•
•
•
•
•
DNA-dubbelhelix
inleiding: 3 pijlers
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
Southern-vlektechniek
genkloning
polymerase-kettingreactie
DNA-sequentiebepaling
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
(RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
(RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
(RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
(RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
• gelelektroforese (met agarosegel)
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: opzet stalen
1
Vliebergh 2004
2
3
DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: opzet stalen
1
Vliebergh 2004
2
3
DNA! Natuurlijk, maar...

gelelektroforese: spanning
-
+
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: spanning
-
+
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: spanning
-
+
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: visualisatie
1000
500
300
200
100
+
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: visualisatie
-
+
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
(RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
• gelelektroforese (met agarosegel)
• interpretatie
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie
1
2
3

400
50
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie
1
5’…CAATT
3’…G
2
3
3’
5’
5’…CAATTG…3’
3’…GTTAAC…5’

400
5’…CAACTG…3’
3’…GTTGAC…5’
50
5’
3’
G…3’
TTAAC…5’
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie
1
2
3

400
50
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie
1
2
3

400
5’…CGGTCTAGGTG
3’
CGGTCTAGGTG……3’
…5’
3’…GCCAGATCCAC
GCCAGATCCAC…
5’
5’…CGGGGTG…3’
3’…GCCCCAC…5’
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
50
gelelektroforese: interpretatie
1
2
3

400
50
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie
1
2
3

400
50
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
resultaat na digestie van
totaal genomisch DNA
1
2
3

400
50
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
basistechnieken van de
recombinant-DNA-technologie
•
•
•
•
•
•
•
DNA-dubbelhelix
inleiding: 3 pijlers
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
Southern-vlektechniek
genkloning
polymerase-kettingreactie
DNA-sequentiebepaling
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
Southern-vlektechniek
agarosegel
nylondrager
autoradiogram
5’…AACTCAGCTG … 3’
3’ GAGTCG 5’
blotting
+ sonde
radiografie
5’ … AACTC 3’
3’ GAGTCG 5’
5’ AGCTG … 3’
3’ GAGTCG 5’
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
Southern-vlektechniek:
afkomst sonde (probe)
• uit gekende aminozuursequentie van eiwit
(degeneratie code!)
• uit mRNA, na omzetting in cDNA
• sonde gebruikt in een ander, verwant
organisme (voldoende complementair!)
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
basistechnieken van de
recombinant-DNA-technologie
•
•
•
•
•
•
•
DNA-dubbelhelix
inleiding: 3 pijlers
restrictiefragment-lengtepolymorfisme
Southern-vlektechniek
genkloning
polymerase-kettingreactie
DNA-sequentiebepaling
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
genkloning
specifieke amplicatie van DNA-fragment
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
lacZ-gen (enzym katalyseert
omzetting “X-gal” naar blauwe
kleurstof)
Vliebergh 2004
pUC18
DNA! Natuurlijk, maar...
ampicillineresistentiegen
genkloning
specifieke amplicatie van DNA-fragment
5’
3’
GAATTC
CTTAAG
Vliebergh 2004
GAATTC
CTTAAG
3’
5’
DNA! Natuurlijk, maar...
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
genkloning
specifieke amplicatie van DNA-fragment
5’
3’
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Vliebergh 2004
3’
5’
GAATTC
CTTAAG
DNA! Natuurlijk, maar...
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
genkloning
specifieke amplicatie van DNA-fragment
+ ampicilline
+ X-gal
bacterie – plasmide = niet-AB-resistent
plasmide zonder donor-DNA = blauw
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
genkloning
specifieke amplicatie van DNA-fragment
blotting
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...
radiografie
genkloning
specifieke amplicatie van DNA-fragment
Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...