Transcript Presentatie les 8/9 Genetische modificatie

Restrictie Enzymen
Bacteriele verdediging tegen virale infecties door
restrictie- (knip) enzymen.
• Restrictie Enzymen scannen de DNA
sequentie
• Vinden een zeer specifieke sequentie
(volgorde) van nucleotiden
• Maken een specifieke ‘knip’ in het DNA
Palindromen in DNA
sequenties
Genetische
5
’
3’
3’
5
’
palindromen zijn
gelijk aan taal
palindromen. Bv.
Lepel of
parterretrap.
Een palindroom
sequentie in DNA
bestaat uit een
gelijke 5’ to 3’
nucleotide sequentie
Restrictie enzymen herkennen en
knippen in een specifieke
palindroom sequenctie, de
restrictie plek, in het DNA. Dit is
meestal een sequentie van 4- tot
6 base paren.
Hae III
HaeIII is een restrictie enzym die
‘zoekt’ op het DNA molecuul tot het
de onderstaande sequentie van 4
basen vindt.
5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’
3’ ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5’
Als de sequentie wordt gevonden knipt Hae
III het DNA op deze plek.
5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’
3’ ACTGCCCAAGCTCCGGTC 5’
Deze knip levert
“blunt ends”
5’ TGACGGGTTCGAGG
3’ ACTGCCCAAGGTCC
CCAG 3’
GGTC 5’
De namen voor restrictie enzymen komen
van:
• het type bacterie waarin het enzym is gevonden
• De volgorde waarin het restrictie enzym is
gevonden en geisoleerd.
EcoRI bijvoorbeeld
R stam van de E.coli bacterie
I omdat het, het eerste E. coli restrictie enzym
was dat is gevonden.
“blunt ends” en “sticky ends”
Hae III produceert een “blunt end”?
EcoRI maakt een gesplitste knip en
produceert een “sticky end”
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
5’ G
AATTC 3’
3’ CTTAA
G 5’
blunt end
sticky end
Meer voorbeelden van restrictie plekken
en restrictie enzymen met hun
knipplekken
Hind III: 5’ AAGCTT 3’
3’ TTCGAA 5’
Bam HI: 5’ GGATCC 3’
3’ CCTAGG 5’
Alu I: 5’ AGCT 3’
3’ TCGA 5’
Het scheiden van Restrictie
Fragmenten, I
Het scheiden van Restrictie
Fragmenten, II
Gel elektroforese
The action of a restriction enzyme, EcoR I
Note: EcoR I gives a ‘sticky’ end
DNA Klonering, II
• Bacteriele plasmides
(klein circulair DNA die
extra info bevatten
naast het reguliere
bacteriele DNA) worden
geknipt met hetzelfde
restrictie enzym
• Een deel ‘vreemd’ DNA
kan dan dus worden
ingebracht in het
plasmide DNA. Zo
ontstaat een
“recombinant”
DNA cloning, III
• De recombinante
plasmides worden
dan gemengd met
bacterien die zijn
behandeld om
makkelijker plasmides
op te nemen
• Dit proces heet
transformatie
• Dit transformeren kan
uitgevoerd worden
mbv een elektrische
puls of een hitteschok (heat-shock)
DNA Cloning, IV
• De plasmides bevatten
genen voor antibiotica
resistentie
• Bacterien die de
plasmides bevatten
kunnen overleven op
platen met dit
antibioticum –de
anderen gaan dood,
dus alleen de
transformanten
overleven.
Screening, I
Andere
screeningsmogelijkheden:
1. Screening op fenotypedoor de insertie van het
‘vreemde’ DNA wordt een
voedingsstof uit de bodem
niet meer omgezet in een
kleurstof.
2. Het gebruik van
antilichamen die binden
aan het specifieke
eiwitproduct dat een goed
gemodificeerde cel moet
produceren.
Screening, II
3. Detecteren van de DNA sequentie van een
gekloneerd gen mbv een probe (DNA
hybridisatie)
Transgenen, de producten van
genetische modificatie
• http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_ge
netica/transgeneoverzicht.html
Met behulp van de DNA sequentie, restictieenzymen,ligase en specifieke
communicatiesignalen die betrokken zijn bij
natuurlijke recombinatieprocessen kunnen
plasmiden volledig ontworpen worden. Hierdoor
ontstaat de mogelijkheid om het modificatie en
recombinatieproces te sturen.