Transcript opgaven - Protagoras

Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
EINDTOETS Biochemie (8RA00) en TENTAMEN Biochemie (8S135)
Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld
25-06-2014 09:00 – 12:00 (totaal 100 punten, plus max. 5 extra voor bonus)
6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie)
Gebruik geen rode pen! Geef uw antwoorden direct op dit tentamen. In principe
volstaat de gegeven ruimte; gebruik indien nodig de achterkant van de specifieke
opgave. Schrijf naam en studentnummer bovenaan iedere pagina!
1
Peptiden en eiwitten
(~25 minuten; 20 punten)
Een biochemicus, tevens heavy metal aficionado, ontdekt in een Engels slachthuis een
nieuw peptide en stelt vast dat de moleculaire structuur eruit ziet zoals onderstaand.
a. Geef de 1-lettercode van de aminozuren in het peptide in de corresponderende
volgorde. (4P)
CARCASS
b. Een gedeelte van bovenstaand peptide blijkt ook te kunnen cycliseren, afhankelijk van
de externe omstandigheden; buiten de cel is het peptide cyclisch en binnen de cel niet.
Legt u uit hoe deze twee toestanden tot stand komen. Gaat u daarbij in op de aminozuren
die hier een cruciale rol spelen en via welk mechanisme dit gebeurt. (4P)
De redox toestand van de omgeving bepaald de toestand van het peptide (binnen de cel
reductief, buiten de cel oxidatief). Door de veranderende redox omgeving wordt er een
zwavelbrug tussen de twee cysteines in het peptide gevormd en verbroken. Als de
zwavelbrug / disulfidebrug gevormd wordt ontstaat een cyclisch peptide. In gereduceerde
toestand (zoals getekend) is het peptide lineair.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. U behandelt bovenstaand peptide met een enzym dat peptide bindingen direct na een
arginine hydrolyseert. Het blijkt dat dit enzym de lineaire vorm van het peptide veel sneller
omzet dan de cyclische vorm. Verklaart u deze observatie en gaat u daarbij in op de
herkenning en binding van het peptide door het enzym. (4P)
Het enzym hydrolyseert peptide bindingen direct C-terminaal van de arginine. De arginine
ligt precies in het gedeelte van het peptide dat een substantiële conformatie verandering
ondergaat na cyclisatie. De binding van het substraat (het peptide) door het enzym gaat
door middel van de binding aan de zijstaarten van de omliggende aminozuren in de
specificiteitspockets (S pockets) van het enzym. Het vouwen in een cyclische vorm zorgt
blijkbaar voor een oriëntering van de peptide zijstaarten (en/of backbone) welke niet
compatibel is met de positionering van de S pockets van het enzym. Hierdoor is de
vorming van het enzym substraat complex sterk verlaagd en daarmee de
omzettingssnelheid / kcat.
d. SDS-PAGE en SEC (size exclusion chromatography ook wel gel-filtratie
chromatografie genoemd) zijn alle twee scheidingsmethoden die scheiden op basis van
grote. Conceptueel verschillen de twee methoden echter sterk; bij SDS-PAGE lopen de
kleinste moleculen het snelst door het scheidingmateriaal, terwijl bij SEC juist de grote
moleculen het snelst door het scheidingsmateriaal lopen. Legt u dit verschil uit door in te
gaan op het fundamentele scheidingsmechanisme van beide technieken. (4P)
Bij SDS-PAGE worden de moleculen (typisch eiwitten) door een vernet / gecrosslinkt
polymeernetwerk getrokken door middel van een elektrisch veld (electrophorese).
Kleinere moleculen diffunderen makkelijker door een polymeernetwerk dan grote
moleculen en lopen dus sneller door het scheidingsmateriaal.
Bij SEC vloeien de moleculen door een scheidingsmateriaal bestaande uit poreuze
polymeerbolletjes. Kleine moleculen diffunderen makkelijker en dieper in de poreuze
bolletjes en worden daardoor vertraagd. Grote moleculen passen niet of minder goed in
de poreuze bolletjes en lopen dus met het vloeistof front mee naar beneden zonder
vertraging.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
e. Een mutatie in de binnenkant van een eiwit waarbij een glycine residue in een valine
gemuteerd is leidt tot een verkeerd gevouwen eiwit. Echter, het eiwit vouwt weer correct,
als op een nabijgelegen positie een isoleucine in een alanine verandert. Legt u uit hoe
uws inziens deze tweede mutatie leidt tot het terugkeren van de capaciteit van het eiwit
om correct te vouwen. (4P)
De eerste mutatie verhindert het correct vouwen van het eiwit omdat een valine meer plek
inneemt dan een glycine (en daarom moet het eiwit een andere vorm / conformatie
aannemen). De tweede mutatie herstelt de vouwing, door een compensatie van het
volume dat aan de binnenkant van het eiwit moet worden opgevuld; alanine is kleiner dan
isoleucine.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
2
Enzymactiviteit
(~25 minuten; 20 punten)
a. Vul de ontbrekende term in op de stippellijn. (5P)
i. Enzymen versnellen de reactiesnelheid door de …………………………… van de
reactie te verlagen. activeringsenergie
ii. Een reactie kan alleen spontaan verlopen als ΔG …………………………… is.
negatief
iii. Een ……………………………. inhibitor heeft vaak een moleculaire structuur die
overeenkomt met het substraat en bindt vaak reversibel aan de actieve site van het
enzym. competitieve
iv. In trypsine bevat de S1 specificiteitspocket een ………………………… welke een
interactie aangaat met een lysine of arginine aminozuur van het substraat.
Aspartaat (eventueel glutamaat of negatief geladen aminozuur ook goed rekenen).
v. In een serine protease wordt de tetraëdrische overgangstoestand gestabiliseerd in het
…………………………………. . Oxyanion gat.
b. Hoe kan er kinetisch onderscheid worden gemaakt tussen competitieve en
noncompetitieve inhibitie? In andere woorden, leg in twee korte zinnen uit hoe de twee
vormen van inhibitie de kinetiek van de reactie beïnvloeden. (4P)
Competitieve inhibitie vergroot de (apparent) KM (en niet Vmax). (De competitieve inhibitie
kan overkomen worden door de aanwezigheid van een grote hoeveelheid substraat)
Noncompetitieve inhibitie verlaagd de Vmax (en niet KM). (De noncompetitieve inhibitor
vormt een inactief EI complex, waaraan het substraat nog wel kan binden, maar niet door
omgezet wordt).
c. Welk nucleofiel wordt door zowel serine-, cysteine-, metallo-, als aspartylproteasen
geactiveerd? (3P) Water / H2O
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
d. Beschrijf in een paar zinnen wat overgangstoestand analoga (transition state analogs)
zijn en waarom deze verbindingen goede inhibitoren (remmers) kunnen zijn van
enzymen. (4P)
Overgangstoestand analoga lijken qua structuur (maar niet qua reactiviteit) heel erg op de
overgangstoestand zoals deze optreedt in het katalytische proces. Deze analoga binden
zeer sterk in de katalytische site, omdat een enzym per definitie een hoge affiniteit heeft
voor de overgangstoestand (want daarmee wordt de activeringsenergie van de reactie
verlaagd). Door deze hoge affiniteit (en door hun afwezige reactiviteit) zijn het goede
inhibitoren.
e. Een enzymatische reactie wordt doorgevoerd bij verschillende substraatconcentraties
en de initiële snelheid van substraatomzetting wordt bij de verschillende
substraatconcentraties bepaald (zie tabel). Bereken/bepaal KM en Vmax voor dit enzym. U
mag hiervoor het voorgedrukte grafiek element gebruiken. (4P)
Substraatconcentratie [S] (M)
Initiële snelheid (V0) (mol/minuut)
3
4.1
5
6.4
10
11.3
30
22.6
90
33.8
-1/KM ~ -0.03 M-1  KM = 33 M
1/Vmax ~ 0.02 minuut/mol  Vmax = 50 mol/minuut
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
3
Membranen en hun eiwitten
(~20 minuten; 15 punten)
a. Teken de dwarsdoorsnede van een micel en van een membraanbilaag waarin u
schematisch laat zien hoe de individuele moleculen hierin georiënteerd zitten en verklaart u
kort uw tekening (waarom zitten de moleculen zo georiënteerd als door u getekend). (5P)
Bilaag
Micel
De twee alkyl-/vetzuurstaarten van de phospholipide geven het molecuul de vorm van een
staafje (in plaats van een conus/kegel vorm zoals bij een vetzuur welke een micel vormt)
waardoor de pakking van het phospholipide in een bilaag optimaal is (en niet past in een
micel met een erg hoge ronding).
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
b. Sommige transmembraaneiwitten overspannen middels een enkele alfa-helix het
celmembraan. Zou een alfa-helix bestaande uit enkel leucines of een alfa-helix bestaande uit
enkel asparagines hiervoor het meest geschikt zijn? Leg uw antwoord uit. (5P)
De alfa-helix bestaande uit enkel leucines. In een alfa-helix zitten de polaire amide-bindingen
van de hoofdketen aan de binnenkant van de helix en de zijstaarten van de aminozuren
steken naar buiten. Deze zijstaarten bepalen dus het karakter van de helix en zijn in contact
met de hydrofobe omgeving van het membraan. Leucine, met een apolaire zijstaart, gaat dus
energetisch gunstige interacties aan met het membraan en asparagine, met een polaire
zijstaart, niet.
c. De biosynthese van ATP gebeurt met behulp van het transmembraaneiwit ATP synthase.
Qua structuur en werkingsmechanisme vertoont de ATP synthase grote overeenkomsten
met het eiwit DNA helicase. Beschrijft u deze conceptuele overeenkomst zo precies mogelijk.
(5P)
Beide eiwitten/enzymen bevatten een hexamere ring van eiwitdomeinen (met 3-voudige
rotationele symmetrie) welke 3 verschillende bindingstoestanden/affiniteiten voor ATP en
ADP + Pi hebben en waarbij deze verschillende affiniteiten gekoppeld zijn aan
conformatieveranderingen in de domeinen. De functionaliteit van beide eiwitten komt tot
uiting door deze conformatieveranderingen geïnduceerd door de 3 verschillende
bindingstoestanden voor ATP en ADP + Pi.
(niet gevraagd) In het geval van de DNA helicase wordt dubbelstrengs DNA uit elkaar
getrokken door de conformatieveranderingen onder consumptie van ATP, terwijl bij de ATP
synthase de conformatieveranderingen (geïnduceerd door de proton gradiënt) de synthese
van ATP bewerkstelligen.
Naam:
Opleiding:……..
Studentnummer:
4
Over DNA
(~20 minuten; 15 punten)
a. Teken de repeterende moleculaire eenheid van de hoofdketen (backbone) van DNA (u
mag de structuur van de base dus weglaten, geef echter wel aan waar deze zich op de
hoofdketen bevindt). Laat in de tekening duidelijk zien hoe de monomeren aan elkaar
verbonden zitten. (6P)
Base
Base
H
H
O
O
O
O CH2
O
P O CH2
O
O
O
P O
O
b. DNA replicatie kan eenvoudig in een reageerbuis in een biochemisch lab gedaan
worden met behulp van de zogenaamde polymerase chain reaction (PCR). Welke
moleculaire componenten (reagentia, katalysator, etc.) heeft u nodig om deze
reactie te kunnen doorvoeren? (3P)
-DNA (dubbelstrengs, maar kan eventueel ook enkelstrengs zijn)
-(DNA) primers
-alle vier de deoxyribonucleoside triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, (d)TTP)
-een warmte stabiele DNA polymerase
(-Mg2+)
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Bij de replicatie van DNA in cellen is naast DNA polymerase ook een RNA polymerase
nodig (ook wel primase genoemd). Leg uit waarom dit zo is. Met andere woorden, wat is
de rol van de RNA polymerase in het DNA replicatie proces? (3P)
DNA polymerase kan niet “uit het niets” beginnen met de synthese van een
oligonucleotide op een templaat. De DNA polymerase heeft een beginpunt / een
bestaande keten met een vrije 3’OH groep nodig, gehybridiseerd op het templaat, welke
hij kan verlengen met nieuwe dexoyribonucleotiden. De RNA polymerase maakt dit
beginstukje / primer voor de DNA polymerase.
d. Topoisomerase inhibitoren worden gebruikt voor de behandeling van sommige
kankers. Legt u uit waarop dit principe zich baseert. (3P)
Tijdens de replicatie van DNA wordt het dubbelstrengs DNA uit elkaar getrokken tot
enkelstrengs DNA (met de DNA helicase). Hierdoor ontstaat er in het daarvoor liggende
dubbelstrengs DNA supercoiling. Topoisomerases heffen deze supercoiling op door het
gespannen DNA te ontspannen door de extra ingebrachte draaiingen terug te brengen.
Zouden de topoisomerases dit niet doen, dan zou dit leiden tot een “knoop” van DNA,
waardoor de separatie van de twee strengen stopt, de ketens breken en de cellen dood
gaan. Door topoisomerases te blokkeren middels de topoisomerase inhibitoren wordt cel
deling dus geblokkeerd en zullen de cellen apoptose ondergaan.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
5
Van DNA naar RNA
(~10 minuten; 10 punten)
a. Vergelijk DNA polymerase met RNA polymerase met betrekking tot de volgende
eigenschappen: (met andere woorden hoe komen ze overeen en hoe verschillen ze) (4P)
i) Monomeer (substraat)
ii) Richting van nucleïnezuur synthese
iii) Nauwkeurigheid
iv) Noodzaak voor een primer
i) DNA verwerkt deoxyribonucleotiden; RNA verwerkt ribonucleotiden
ii) Beiden van 5’  3’ richting
iii) DNA polymerase werkt met een hogere nauwkeurigheid dan de RNA polymerase
(door het additionele editing systeem)
iv) DNA polymerase (I) heeft een primer nodig; RNA polymerase niet.
b. We kennen verschillende soorten RNA moleculen. Beschrijf kort wat mRNA, tRNA en
rRNA zijn, wat voor structuur ze vormen en wat hun rol is. (6P)
mRNA is messenger RNA, een lineair ongevouwen keten; het resultaat van de
transcriptie van een DNA gen in RNA. mRNA is de drager van de genetische informatie
die uitgelezen moet worden en getranslateerd in eiwit moleculen, het templaat voor eiwit
synthese.
tRNA is transfer RNA en draagt een geactiveerd aminozuur (in relatie met een anticodon)
en brengt dit naar het ribosoom om ingebouwd te worden in de groeiende eiwitketen.
tRNA’s zijn relatief klein (75 nucleotiden) en hebben een klaverblad structuur met een
gecontroleerde afstand tussen anticodon en aminozuur om zo universeel door het
ribosoom geprocesseerd te worden. Ieder aminozuur heeft zijn eigen tRNA(s).
rRNA is ribosomaal RNA en de hoofdcomponent van het ribosoom (samen met eiwitten).
Er zijn een aantal verschillende rRNA moleculen die gezamenlijk en met de eiwitten de
kleine en grote subunit van het ribosoom vormen. Hierin speelt het rRNA een katalytische
rol.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
6
Van RNA naar eiwit
(~20 minuten; 20 punten)
a. Geef een mogelijke nucleotide sequentie
voor de coderende DNA streng van
onderstaande peptide sequentie. Geef
daarbij aan waar zich de 5’ en 3’ uiteinden
bevinden. (5P)
Lys-Trp-Pro-Val
5’-AA(A/G)TGGCCNGTN-3’
N is iedere DNA base
b. Waarom is een enkele (single) nucleotide deletie of insertie in een gen potentieel
dodelijk? (5P)
Er zit geen punctuatie in de genetische code; deze wordt continue uitgelezen vanaf het
startcodon. Iedere set van 3 basen codeert voor 1 aminozuur in de eiwit sequentie. Ook
als er dus slechts 1 base minder of meer is leidt dit tot een compleet andere set van
codes (alle daaropvolgende basen worden als het ware 1 positie opgeschoven), wat
resulteert in een nonsens sequentie en een nonfunctioneel eiwit. Als dit eiwit kritisch
belangrijk is (wat veel meeste eiwitten zijn), dan leidt dit dus tot een non-functioneel
organisme.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Aminoacyl-tRNA synthetasen zijn de enige component in het hele proces van de
genexpressie welke de genetische code decoderen. Legt u dit uit. (4P)
Deze enzymen lezen het tRNA anticodon uit en beladen het tRNA met het
overeenkomstige aminozuur. En zetten dus nucleïnezuurinformatie om in eiwitinformatie.
(het ribosoom koppelt nucleïnezuurinformatie aan andere nucleinezuurinformatie codonanticodon).
c. Wat is de rol van het aminozuur zelf in het op de juiste plek plaatsen van de beladen
aminoacyl-tRNA op het codon? (4P)
Geen. Alleen de anticodon-codon interactie is verantwoordelijk voor de juiste tRNA
selectie.
d. In het ribosoom wordt de groeiende eiwitketen steeds overgedragen op het nieuw
aangeleverde aminoacyl-tRNA. Op welk molecuul wordt de eiwitketen overgedragen als
het stopcodon op het mRNA is bereikt? (2P)
Water / H2O
Bonusvraag
(~1 minuut; max. 5 punten extra)
Waarvoor kregen in 2012 Brian Kobilka en Robert Lefkowitz de Nobelprijs voor de
Scheikunde?
Voor de studie naar G-eiwit gekoppelde receptoren