Transcript Петлевая изотермическая амплификация ДНК (LAMP)
Петлевая изотермическая амплификация ДНК (LAMP) в молекулярной диагностике Константин.А. Мирошников
Лаборатория молекулярной биоинженерии Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Амплификация ДНК in vitro. Полимеразная цепная реакция Kary Mullis
Нобелевский Лауреат 1993
Полимеразная цепная реакция. Развитие метода и приложения.
1. Миниатюризация реакции 2. Специализированные ферменты 3. Детекция в реальном времени 4. Дискретные реакции (nested PCR, polony PCR, digital PCR, multiplex PCR) 5. Автоматизация пробоподготовки, протокола реакции и детекции 1. Молекулярное клонирование. Реком бинантные продукты генов 2. Определение последовательности ДНК. NextGen sequencing 3. Молекулярная диагностика (патогены, мутации, генетические модификации)
Молекулярная диагностика патогенов.
Применяемые/перспективные методы
1. Культуральные методы 2. Иммунологические методы (ELISA) 3. ПЦР-диагностика 4. Биосенсоры 5. Масс-спектрометрия 6. Альтернативные методы амплификации нуклеиновых кислот
Недостатки ПЦР
1. Точное термоциклирование. Дорогое оборудование 2. Чувствительность полимераз к загрязнениям. Сложная пробоподготовка 3. Затрачиваемое время (несколько часов) 4. Квалификация персонала.
Изотермическая амплификация ДНК
- Хеликазо-зависимая амплификация (HAD, SIAC). - Амплификация по принципу «катящегося кольца» (Rolling circle amplification, RCA) - Гибридизационная амплификация - Амплификация с замещением цепи (SDA) - Nickase (эндонуклеазно-полимеразная реакция) - Петлевая амплификация (LAMP)
L
oop-mediated Isothermal
AMP
lification (
LAMP
)
L
oop-mediated Isothermal
AMP
lification (
LAMP
)
Молекулярные характеристики LAMP
Фермент: большая субъединица ДНК полимеразы
Bacillus stearothermophilus (Bst-
polymerase) Eiken, NEB, 3M;
Geobacillus spp
polymerase (Optigene) Реакция более специфична к последовательности матрицы (4-6 праймеров vs 2 у ПЦР) Выход реакции в 10-100 раз (в зависимости от метода детекции) выше, чем у ПЦР чувствительность Время реакции 15-40 мин vs 2-3 часа ПЦР RT стадия и LAMP в одной пробирке Меньшая чувствительность к загрязнениям и сторонним нуклеиновым кислотам
Аппаратурное оснащение LAMP
• Приборы на базе термоблока (не требуется точного термоциклирования) Genie III (Optigene) • Проведение реакции возможно в водяной бане, градуированной микроволновой печи и химическом термопакете • Качественное определение результата возможно визуально и с помощью бытовых сканнеров Isothermal detection(3M) OC Sensor (Eiken)
Методы детекции LAMP
1. Визуализация продуктов реакции электрофорез + окрашивание бромидом этидия/нитратом серебра 2. Флуоресцентная детекция в растворе интеркалирующими агентами (SybrGreen, PicoGreen,Yo Pro-Iodide, PicoGreen) - Optigene
Методы детекции LAMP - II
1. Турбидиметрическая визуализация – образование нерастворимого пирофосфата 2. Турбидиметрия + флуоресценция. Calcein/Naphtol Blue с пирофосфатом магния – Eiken 3. BART - Турбидиметрия + люминесценция – 3М
Методы детекции LAMP - III
1. Электрохимическое определение продуктов 2. Реакция биотин-СТР продуктов с Nanogold частицами 3. Surface Plasmon Resonance 4. Флуоресцентно-меченые праймеры
Разработанные диагностические приложения Коммерческие наборы:
Escherichia coli
,
Listeria, Salmonella
(3М)
Mycobacterium
,
Legionella
,
Vibrio cholerae
,
Campylobacter
(Eiken)
Экспериментальные разработки:
- более 100 вирусов человека, животных и растений, - более 100 видов бактерий (включая генотипирование) - простейшие паразиты (токсоплазма, малярийный плазмодий, эймерия, бабезия, амеба) - Нуклеотидный полиморфизм - Детекция GMP-маркеров
Попытки сертификации LAMP диагностики
1061 пациент в Индии, Вьетнаме,Уганде и Перу
Метод
LAMP (Eiken) Мазок флуоресц.мик роскопия
Точность
97,8% 94,2%
Стоимость
$10,48 $6,85 PCR (Amplicor MTB Roche) 98,0 $12,2
Дальнейшее развитие метода
• • • • •
Миниатюризация реакции (биочипы, микрофлюидные картриджи) LAMP/ детекция на твердой подложке Lateral flow наборы Мультиплексные приложения Совершенствование ферментов и методов детекции