Transcript Лекция 8.
Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно уже решены другими.
Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся неудачными.
Александр Сергеевич Серебровский
1. ПЦР – общие понятия и принципы работы.
2. ПЦР в реальном времени.
Основные принципы ПЦР
В 1983 году Мюллисом была разработана технология полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая получила очень большое распространение.
В настоящее время ПЦР признана как наиболее производительная и относительно простая технология амплификации (многократного копирования) небольших количеств образцов ДНК, которая способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов (Newton, Graham, 1997).
Kary Baron Mullis Существующие классифицировать по типам используемых праймеров. В ходе ПЦР могут быть использованы (искусственно синтезированные нуклеотидные последовательности), которые комплементарно соответствуют тем последовательностям нуклеотидов, которые обычно с большей или меньшей частотой встречаются в методы полимеразной неспецифические геномах разных цепной видов реакции (произвольные) (random можно праймеры primed amplification — произвольно праймированная амплификация); изучаемому региону ДНК - группа STS-маркеров (Sequence-Tagged Sites).
и специфические праймеры, сконструированные (синтезированные) на основе тех нуклеотидных последовательностей, которые примыкают к
Основные принципы ПЦР. Random PCR
В 1990 году, независимо друг от друга, две исследовательские группы предложили Одна группа ( для выявления полиморфизма ДНК использовать полимеразную цепную реакцию с одним коротким олигонуклеотидным праймером произвольной структуры. После электрофоретического разделения и визуализации продуктов ПЦР фрагменты амплифицированной ДНК различной молекулярной массы использовали как молекулярные маркеры для анализа генома.
Williams et al., 1990 ) назвала такие молекулярные маркеры — RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) , другая ( Welsh, McClelland, 1990 ) AP-PCR (Arbitrary Primer PCR) Несколько позже были предложены и другие похожие методы .
( В Caetano-Anolles et al., 1991 ( Булат и др., 1992 ) Все они основывались Достоинства метода: случае соответствующих гибридизации, применения ) DAF (DNA Amplification Fingerprinting) УП-ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) .
па синтезированных праймеров.
использовании произвольной структуры и отличались только, в основном, длиной "произвольных" необходимости в предварительном клонировании и секвенировании фрагментов авторадиографии генома, или в одного праймеров других трудоемких методов визуализации продуктов анализа.
праймера нет использовании достаточно
Основные принципы Random PCR анализа (гаплоидные ткани)
Основные принципы ПЦР. Random PCR
Произвольная RAPD использования амплификация амплифицированная является полиморфная недетерминированным процессом, не требующим предварительного знания матричной последовательности и использующим единичные или множественные сайты в геноме. Этот тип амплификации может использовать один или несколько произвольных праймеров или комбинацию произволь ного и направленного праймеров к специфическим, но неизвестным сайтам в геноме, многие из которых являются полиморфными.
rPCR (Random Polymerase Chain Reaction – произвольная ПЦР).
Этот метод позволяет конструировать библиотеки полных кДНК из очень малого количества РНК (эквивалентного количеству РНК, содержащейся в одной эукариотической клетке, ста клетках бактерий или в ста тысячах частиц ретровируса). В качестве праймера для синтеза кДНК используют универсальный праймер, содержащий на 3'-конце гексамер с призвольной последовательностью (Froussard, 1993).
анализ (Random Amplified Polymorphic DNA — произвольно достаточно произвольных выполнения праймеров ДНК).
нет Оригинальность RAPD-анализа заключается в двух особенностях: при амплификации ДНК применяется только один праймер, так как мишенью являются, как принято считать, инвертированные повторы в геноме; для следующих условий: необходимости в предварительном клонировании и секвенировании соответствующих фрагментов генома. При подборе праймеров для RAPD-анализа олигонуклеотидная последовательность праймера должна содержать oт 50 до 80% G+C оснований, а его длина должна быть около 10 оснований.
Основные принципы ПЦР. Random PCR
RAPD-анализ характеризуется использовании ПЦР-условий, праймированная ПЦР).
повышает информационно ДНК-профили, большинства поэтому эффективность насыщенные полученные при следующими типов представлен 5-12 амплимерными зонами; RAPD-маркеры обладают доминантным характером проявления; RAPD не включает в себя гибридизацию/авторадиографию или другие трудоемкие методы визуализации продуктов анализа; RAPD чувствителен к изменениям воспроизведение быть получено лишь при максимальной стандартизации условий.
AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction — произвольно В данном типе ПЦР используются праймеры, сходные по длине с таковыми в классической ПЦР (15- 25 нуклеотидов). Особенностью этого метода является проведение отжига праймера в нескольких первых циклах при более низкой, чем оптимальная, температуре (так называемый "мягкий" отжиг), что праймирования "жестких" циклах. Продукты амплификации разделяют в агарозном геле и визуализируют бромистым этидием.
профили организмов - от бактерий до человека.
свойствами: праймеров результатов DAF (DNA Amplification Fingerprinting фингерпринтинг ампл-ной ДНК).
При DAF используют праймеры длиной 5-8 нуклеотидов. Сложные ДНК RAPD-анализе при с получают при RAPD-спектр может дальнейших в полиакриламидном геле и окрашивают серебром для обнаружения пикограммовых количеств ДНК. В результате DAF с октамерным праймером образуются фингерпринтеры в 3-10 раз более сложные, чем декамерным праймером. Техника DAF использовалась для характеристики многих
Основные принципы ПЦР. Random PCR
Наибольшую популярность среди данного типа методов получил RAPD. Он использовался для всестороннего исследования генома организмов: конструирование генетических карт; анализ генетической структуры популяций; генотипирование; маркирование признаков и др.
В то же время, этот и подобные ему методы были не лишены некоторых недостатков: 1) "произвольные" (случайные) маркеры, обладая доминантным характером проявления, не могли быть использованы при типировке гомозиготных и гетерозиготных амплифицированных образцов; 2) при интерпретации разрешающей амплимеров, способности исходя из применяемых различной гелей, необходимо было также учитывать и явление комиграции; 3) существовавшие проблемы воспроизводимости: результаты оказались очень чувствительны к изменениям ПЦР-условий, поэтому достоверные результаты можно было получить лишь при максимальной стандартизации условий.
Random PCR (RAPD, DAF, AP-PCR), AFLP – интерпретация результатов
Название зоны 1 2 3 Номера образцов 4 5 6 7 8 9 10 Oligo 12 2840 1 Oligo 12 670 Oligo 12 530 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 Oligo 12 380 1 1 1 0 0 0 0
RAPD-спектр корневой губки при использовании праймера Oligo 12 (диплоидные ткани, доминантный характер проявления аллелей)
0 0 0
RAPD, DAF, AP-PCR, AFLP. Анализ полученных результатов проводят визуально (RAPD, AP-PCR), либо с помощью специального программного обеспечения вследствие сложности электрофоретического спектра (DAF, AFLP). Данная группа маркеров характеризуется доминантным типом проявления и диаллельной системой: "1" наличие ампликона (доминантный аллель) и "О" - отсутствие ампликона (рецессивный аллель), в той или иной зоне гелевой пластины. Исходя из доминантного использовании характера диплоидных проявления или маркеров полиплоидных данной тканей, группы, не различать гомозиготные (по доминантному аллелю) и гетерозиготные генотипы образцов, при представляется возможным.
характеристике описывается (фенотип) ПЦР продуктов (таблица). Обозначение зон производится по названию праймера, отобранного для полимеразной цепной реакции, и размера зоны (в парах нуклеотидов) в надстрочнике. Так, например, зона размером в 670 п.н. в электрофоретическом спектре продуктов ПЦР с праймером Oligo 12 обозначается Oligo 12 670 .
При организма спектр
Random PCR (RAPD, DAF, AP-PCR), AFLP; CAP – интепретация результатов Важным моментом при проведении RAPD-анализа является необходимость использования только специфических зон для данного вида, поскольку включение минорных, артефактных зон может привести к искажению результатов анализа.
Наличие артефактных зон может быть связано с загрязнением изучаемых препаратов чужеродной ДНК. Появление минорных фракций может быть вызвано, как наличием внешнего загрязнения, так и неправильно подобранными условиями отжига. Устранение минорных зон может быть достигнуто увеличением температуры отжига, снижением концентрации хлорида магния в реакционной смеси и т. д. Артефактные зоны из анализа исключаются и в дальнейшем не учитываются.
При использовании новых RAPD-праймеров необходимо провести предварительное исследование воспроизводимости выявляемых обладающие полной воспроизводимостью.
величины (в парах нуклеотидов) выявленных зон.
спектров.
По окончании сравнительного анализа следует оставлять только наиболее четкие зоны, RFLP, САР. Интерпретацию полученных спектров проводят исходя из количества и RFLP-спектр образцов дуба черешчатого при использовании (диплоидные ткани, характер проявления аллелей) комбинации рестриктазы Hindlll и пробы Rbkl 12 кодоминантный Аллели: А— 1 зона: 2220 п.н. (отсутствие рестрикции), В — 2 зоны: 2120 п.н. и 100 п.н., С — 2 зоны: 1660 п.н. и 560 п.н.
Генотипы образцов Rbkl 12(HindIII): 1 —АВ, 2-5,7 — АА, 6 — АС, 8 — СС
Основные принципы ПЦР. Random PCR
Таким образом, характера исходя наследования из разбросанных по всему геному.
неспецифичности RAPD-локусов и и доминантного сходных маркеров, использование данной технологии в популяционно-генетических и таксономических исследованиях, как оказалось, имело ряд ограничений.
При проведении селекционных работ, наоборот, RAPD-анализ являлся достаточно эффективным методом, особенно для типировки генотипов, особей, клонов, форм и т.д. Это связано с большим количеством маркеров, выявляемых с помощью данного метода. При использовании даже одного какого-либо праймера, RAPD-спектр обычно представлен в виде пяти и более ампликонов, т.е. маркерных фрагментов. Таким образом, применяя различные праймеры, можно выявить и в дальнейшем использовать сотни генетических маркеров.
Это позволяет сравнивать большое количество фрагментов ДНК, Однако при определенных условиях эти достоинства становились недостатками преодоления данного этой метода.
проблемы или определенного фрагмента ДНК.
В ряде необходимо случаев было некоторые амплифицированные фрагменты встречались у многих особей одного или разных видов, что затрудняло их диагностирование. Для синтезировать специфические праймеры для амплификации только конкретного гена
Основные принципы ПЦР. STS PCR
Технологии, которые позволяют проводить ПЦР-анализ отдельных детерминант объединены под общим названием STS (Sequence-Tagged Sites).
В эту группу вошли такие методы как SCAR, EST, ISSR, CAPS, STMS и др., отличающиеся по своим подходам к выявлению видоспецифических фрагментов.
В случае Regions) , метода SCAR (Sequence-Characterised Amplified отдельные первоначально с помощью ПЦР-анализа с произвольными праймерами устанавливают фрагменты, которые могут маркировать синтезируют формы или виды, специфические затем ампликоны праймеры, вырезают из геля, секвенируют для установления нуклеотидной последовательности и комплементарные началу и концу данного участка ДНК (Antolin, 1996).
При чала использовании выделяют из метода клетки EST (Expressed специфичную для Sequence данного Tag) сна организма матричную РНК, затем, с помощью фермента обратной транскриптазы, синтезируют кДНК, комплементарную этой мРНК, секвенируют ее и синтезируют праймеры для начала и конца гена, или его фрагмента (Karp et al., 1997).
Одним из наиболее популярных методов, идентификации организмов одного вида, явился используемых SSR-метод Sequence Repeats ), или STMS-метод (Sequence-Tagget в основе которого лежит анализ микросателлитов.
для (Simple Microsatellites) ,
Основные принципы ПЦР. STS PCR
Амплификация VNTR (Variable со специфическими терминированным процессом, требующим знания последовательности матрицы, а мишенью являются один определенный либо многочисленные сайты амплификации на обеих нитях ДНК.
В зависимости от целей и задач исследований можно выделить несколько типов ПЦР со специфическими праймерами: Number of Tandem праймерами Repeats является де варьирующее число 9-10 до тандемных несколько повторов).
сотен Значительная нуклеотидов часть повторяющейся (сателлитной) ДНК состоит из тандемно повторяющихся копий длиной 1-6 нуклеотидов (микросателлиты, или SSR - Simple Sequence Repeat) и от каждая (минисателлиты).
Минисателлитный локус может насчитывать до нескольких сотен повторов, микросателлитный локус - до ста повторов. Мутации типа инсерция/делеция, изменяют число повторов, т. е. общую длину такой многокопийной последовательности. Таким образом, аллели данных локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий.
Большинство микросателлитных локусов полиморфны и имеют 5 и более вариантов. Применение этого метода в "ДНК-дактилоскопии" играет существенную роль.
Так, частотой ошибки менее 0,01%.
например,использование только 5 микросателлитных локусов позволяет типировать особи в популяции с
Основные принципы ПЦР. VNTR анализ
Полиморфизм существование более чем одного варианта последовательности ДНК (гена, маркера) с частотой, превышающей частоту обратного мутирования. (на практике >1%)
Основные принципы ПЦР. VNTR анализ
Микро- и минисателлитные маркеры характеризуются кодоминантным типом проявления (за исключением "нулевых" аллелей). Таким образом, гомозиготные образцы представлены на фореграммах одной фракцией, а гетерозиготные — двумя (диплоидные ткани) и более (полиплоидные ткани) электрофоретическими вариантами.
Схема выявления изменчивости для VNTR-локусов
Основные принципы ПЦР. STS PCR
SCAR (Sequence-Characterised Amplified Regions - амплифицируемые регионы с известной нуклеотидной последовательностью).
Данные маркеры представлены ДНК-локусами, для которых определена нуклеотидная последовательность). Если данная область является структурным геном или его фрагментом, то данный маркер обозначается как EST-маркер (Expressed Sequence Tag - экспрессируемые нуклеотидные последовательности). Дополнительный рестрикционный анализ SCAR маркеров получил название CAPS-анализ (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence полиморфизм рестрикции амплифицированных тидных последовательностей), или PCR-RFLP .
нуклео Общий принцип выявления изменчивости SCAR-локусов (гаплоидные ткани)
Детекция полиморфизма по одиночным нуклеотидам (SNP)
Общий принцип выявления полиморфизма SCAR-локусов (диплоидные ткани)
Основные принципы ПЦР. STS PCR
Ассиметричная ПЦР.
Используется для получения продуктов амплификации в том, что один из двух праймеров для ПЦР берется в 100-кратном избытке.
На в одноцепочечной ранних Инвертированная ПЦР.
циклах форме.
реакции Используется при Его секвенирования или использования в качестве зонда.
суть происходит заключается образование двухцепочечной ДНК и экспоненциальный рост ее количества. Как только пул лимитирующего праймера исчерпывается (примерно к 20-му циклу), начинается образование одноцепочечной ДНК. Ее накопление носит линейный характер, но этого оказывается достаточно для получения одноцепочечной ДНК в количествах, необходимых для изучении промоторных областей генов известных белков, сайтов интеграции провирусов, мобильных элементов. ДНК гидролизуется рестриктазой, вносящей разрывы не внутри известной последовательности, а в некоторых точках правее и левее ее. Образующийся фрагмент ДНК замыкается в кольцо с помощью ДНК-лигазы и амплифицируется в результате ПЦР. Основное отличие от стандартной ПЦР заключается в том, что праймеры, гибридизующиеся с концевыми участками известной последовательности, направлены З'-концами не внутрь ее, а наружу. В результате амплифицируются фланкирующие участки ДНК.
Основные принципы ПЦР. STS PCR
Заякоренная ПЦР.
кислоты, подлежащего последовательность Используется в случаях, когда для участка нуклеиновой лишь мер, в случае молекул РНК, для которых легко определить лишь 3' концевую последовательность). Метод состоит в том, что с молекулы РНК получают кДНК-копию, амплификации, к для одного З'-концу известна праймера которой нуклеотидная (напри пристраивают поли(dG)-блок с помощью терминальной трансферазы. Амплификацию такой кДНК проводят при участии "заякоренного" праймера, содержащего на 3'-конце поли(dC)-последовательпость и потому гибридизующегося с поли(dG-блоком, и "специфического'" праймера, синтезированного на основании известной 3' концевой последовательности РНК.
Также имеются и другие STS-технологии, позволяющие диагностировать различные организмы. Анализ по ним проводится на основании положительного или отрицательного результатов ПЦР-тестов.
Аллель специфичная ПЦР.
ПЦР в реальном времени. Основные протоколы.
Методы ПЦР в реальном времени можно разделить на две основные группы, различающиеся по способам генерации портерной флюоресценции: 1) применение интеркалирующих флюоресцентных агентов, флюоресценция которых значительно возрастает при связывании с двухцепочечной ДНК (интеркалирующим красителем наиболее часто является SYBR Green); 2)использование меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку PCR-продукта (протоколы TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler).
ПЦР в реальном времени. SYBR Green протокол
SYBR Green на анализ базируется на детекции и количественом определении флюоресцирующих комплексов ДНК-SYBR Green (Morrison et al., 1998).
Особенность красителя образовывать комплексы только с двухцепочечной молекулой ДНК, которая в ПЦР присутствуют только на стадии отжига (праймер-матрица ДНК) и элонгации (ампликон). Таким образом, изменение флюоресцентной эмиссии конечном этапе SYBR элонгации Green заключается в способности каждого последующего цикла, в основном, отражает увеличение числа ампликонов в ходе ПЦР.
Достоинства: технология SYBR Green наиболее дешевая и простая в исполнении, позволяющая вносить элементы оптимизации в протекание реакции амплификации.
Недостатки:
-
применение SYBR Green накладывает очень высокие требования к специфичности реакции. Это необходимо иметь в виду при выборе праймеров;
-
отсутствие контроля специфичности образовавшегося продукта; - при использовании данной технологии можно работать только с одной реакцией в одной реакционной смеси (в отличие, например, от TaqMan, где использование проб в одной точность проводимого исследования.
реакционной смеси потенциально ограничивается возможностями конкретного амплификатора) и, при небольших количествах исходного образца ДНК, значительно уменьшается
ПЦР в реальном времени. TaqMan протокол
TaqMan ПЦР участку, лять быть его за основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы (Held et al., 1996). В реакционную смесь добавляют 2 праймера, комплементарных областям, фланкирующих амплифицируемый локус, и ДНК-зонд (проба), меченный на 5'-конце флюоресцентным красителем (Ф), а на 3'-конце — тушителем флюоресценции (Т). Зонд комплементарен находящемуся счет детектировано.
внутри ампликона.
испускаемое флюоресцентной меткой излучение. При отжиге зонд связывается с комплементарным участком ДНК внутри ампликона. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеп 5'-экзонуклеазной Таким образом, Тушитель активности.
флюоресцентная метка отделяется от тушителя, и ее свечение может увеличение В поглощает результате флюоресценции прямо пропорционально накоплению числа ампликонов.
ПЦР в реальном времени. TaqMan протокол
Основным недостатком технологий, основанных на применении меченных технологии При флюоресцентными и частности, TaqMan, является достаточно высокая их стоимость по сравнению с SYBR Green. Следует иметь в виду, что при использовании TaqMan оптимизации реакции в отличие от применения интеркалирующих флюоресцентных агентов, при неудачно подобранных комбинациях зондов и праймеров придется подбирать новые, что еще больше увеличивает стоимость исследований.
использовании в агентами имеется качестве образца матрицы для последующей амплификации.
олигонуклеотидных меньше возможностей молекулы РНК, зондов, а для не ДНК, в реакционную смесь добавляются реагенты для проведения обратной транскрипции и в программе ПЦР на первом этапе выпол няется синтез кДНК, которая будет выступать в качестве исходной
ПЦР в реальном времени. Molecular Beacon & Ligft Cicler
Molecular Beacons отличается от TaqMan тем, что концы зонда (на которых находятся, соответственно, метка и тушитель флюоресценции) комплементарны друг другу (Mhlanga, Malmberg, 2001). В результате, при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют структуру типа "ручки сковородки" (stem-loop), где зона комплементарности зонда к изучаемому локусу находится в петле. При гибридизации зонда с матрицей вторичная структура разрушается, флюоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны и флюоресценция от метки может быть детектирована.
LightCycler технология флюоресцентной меткой (Wittwer et al., 1997). Принцип метода заключается в основана на использовании двух зондов, меченных переносе энергии от одного находящегося на 3'-конце первого зонда (Д), ко второму флюорофору, находящемуся на 5'-конце второго зонда (А), который происходит в том случае, когда расстояние между флюорофорами составляет 1-3 нуклеотида. Все описанные технологии различаются как по сложности постановки, так и по цене. Использование двух меченых зондов в ходе анализа делает данный метод одним из наиболее затратных.
флюорофора,
ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов
Real-Time (например, При qPCR.
Данный метод анализа позволяет получать как количественные данные о концентрации исходного локуса в образце при изучении концентрации определенных видов микроорганизмов в тканях тела или воде), так и качественные данные по генотипической структуре (генотипирование).
использовании SYBR Green протокола, генотипирование основано на индивидуальных значениях температур плавления различных ампликонов, что связано с варьированием размера и нуклеотидного состава изучаемых фрагментов ДНК. Для оценки температуры плавления ампликонов в конце программы амплификации проводят анализ кривой плавления получившихся ПЦР-продуктов. В большинстве случаев, поставляемое программное обеспечение, используя анализ производной функции интенсивности флюоресценции в зависимости от температуры (-dl/dT), представляет данные в виде пиков, отражающих температуры плавления ампликонов. В случае наличия одного пика — образец характе ризуется наличием двух одинаковых аллелей, т. е. определяется как гомозигота. Если присутствует два различных пика — образец определяется как гетерозигота.
ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов
Кривые плавления гетерозиготного (слева) и гомозиготного (справа) по локусу QZag12 образцов дуба скального (диплоидные ткани) и их электрофоретические профили.
При использовании анализа кривых плавления для генотипирования, важными моментами являются: отсутствие неспецифических ампликонов в ПЦР-спектре, которые могут давать ложные пики, а также наличие достоверных различий температур плавления аллельных вариантов. При выполнении данных требований, количество выявляемых аллелей может составлять 5-7 вариантов.
Установление генотипа на основании использования TaqMan протокола, требует использования количества зондов, равного числу искомых аллельных вариантов. При одновременном использовании нескольких зондов в ПЦР-смеси, они должны отличаться спектрами испускания света для одновременной детекции на разных каналах (разных длинах волн) фотодатчика RealTime-термоциклера.
ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов
Графики изменения интенсивности сигнала для гомозиготных и гетерозиготных образцов при детекции двух различных длин волн в ходе TaqMan протокола.
Генотипы образцов: 1 — АА, 2 — АВ, 3 — ВВ.
Интерпретация получаемых результатов заключается в следующем: у гомозиготных организмов спектре испускания.
в ходе ПЦР будет происходить расщепление зонда только одного типа, и, соответственно, увеличение интенсивности свечения только в одном определенном волновом спектре.
У гетерозиготных организмов в ходе реакции будет происходить расщепление зондов двух типов (в случае диплоидных тканей) и, соответственно, нарастание сигнала для двух различных длин волн в