Transcript SNP-Genotypisierung - Bioinformatics Graz

Molekulare Diagnostik
SNP-Genotypisierung
SNP: Single Nucleotide
Polymorphism
99,9% der DNA Sequenzen aller Menschen sind ident.
80% der verbleibenden 0,1% entsprechen SNPs.
SNP nennt man den Austausch einer einzelnen Base:
Bsp.: GAACCT wird zu GAGCCT
SNP kommt etwa alle 100-300 bp im Genom vor.
Damit gibt es etwa 10-30 Millionen potentielle SNPs.
4 Millionen sind bereits identifiziert
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
1
Molekulare Diagnostik
Vererbung von SNP
• Meist nicht als einzelne SNPs sondern als Blöcke
(benachbarte SNPs) vererbt
• Blöcke bezeichnet man als Haplotyp
• Haplotyp Blöcke werden über Generationen ohne
Rekombination weitervererbt (Stammbaumnachweis,
Evolutionsnachweis, Populationsstudien)
• Sprich, auch wenn ein Block viele SNPs enthält, reicht die
Identifizierung einiger SNPs um Haplotyp zu identifizieren
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
2
Molekulare Diagnostik
Verbreitete Krankheiten und
dazugehörendeSNPs
• Die meisten Krankheiten werden nicht von einzelnen SNPs
hervorgerufen, sondern durch komplexe Interaktionen mehrerer
Gene, Umweltfaktoren und Lebensstil.
• Zusammenhänge zwischen Krankheit und SNPs bzw. Haplotypen
werden immer wichtiger für Diagnose.
• Umso mehr Krankheiten bestimmten SNPs/Haplotypen
zugeordnet werden können, umso einfacher wird ihre Diagnose.
• Diagnose durch Analyse spezifischer SNP-Muster
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
3
Molekulare Diagnostik
SNPs und biologische Effekte
SNPs sind verantwortlich für:
-Beneficial Drug Response
-Adverse Drug Response
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
4
Molekulare Diagnostik
SNP abhängiger Response
• Mensch und Tier:
Medikamente führen zum gewünschten Erfolg:
Heilung,
Repression, Linderung (benef drug resp)
Medikamente führen zu keiner Besserung oder
überhaupt
zum Tod (adverse drug resp)
• Pflanzen: genet. Manipulation von/durch SNPs könnte Erntertrag
erhöhen
Vorteil: Reduktion von Herbiziden, Insektiziden,
Kunstdünger
• Bakterien/Viren: SNPs verursachen
Medikamentenresistenz
(Krankenhauskeime!!!)
HIV ist schwer zu behandeln, weil Mutationsfrequenz
des Virus in den SNPs sehr hoch
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
5
Molekulare Diagnostik
Diagnose von SNPs
• Allel Spezifische (Oligonukleotid) Hybridisierung
• Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation
• Primer Verlängerung
• Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
6
Molekulare Diagnostik
Allel Spezifische Hybridisierung
(AS oder ASO)
Testprinzip: Unterscheidung zweier DNA
Moleküle, die in einer Base variieren, mittels
Hybridisierung.
Floureszenz markierte PCR Produkte werden zu
immobilisierten Oligonukleotiden (=SNP
Sequenzen) gegeben. Hybridisierung erfolgt
extrem stringent (was nicht exakt bindet wird
weggewaschen). Hinterher wird die Intensität
der Floureszenz gemessen.
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
7
Molekulare Diagnostik
Allel Spezifische Hybridisierung
(AS oder ASO)
Zugabe floureszenzmarkierter PCR Produkte zu immobilisierten
Oligos (SNPs), Bindg. sehr stringent. Floureszenz indirekt prop.
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
8
Molekulare Diagnostik
Allel Spezifische Oligonukleotid
Ligation
• Es werden Oligos designt, die komplementär zur
Zielsequenz (zu untersuchende Sequenz, durch
PCR hergestellt) sind.
• Am 5´oder 3´Ende dieses Oligos befindet sich
die allelspezifische Base
• Liegt ein SNP vor:
Oligonukleotid ligiert nicht an Zielsequenz
• Liegt kein SNP vor:
Oligonukleotid ligiert an Zeilsequenz
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
9
Molekulare Diagnostik
Allel Spezifische Oligonukleotid
Ligation
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
10
Molekulare Diagnostik
Primer extension
Das zu untersuchende Gen wird wiederum mittels PCR amplifiziert
Daraufhin folgt eine Einzelbasen-Sequenzierung
Terminatoren Didesoxynukleotide (verhindert weiteren Anbau von Basen)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
11
Molekulare Diagnostik
Allel Spezif. Primer Extension
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
12
Molekulare Diagnostik
Sequenzierung gewisser DNAFragmente
• Das Sequenzieren ist meist die Untersuchungsmethode
der Wahl bei SNPs
• Zwei Möglichkeiten der Primer Verlängerung:
a) dye-Primers und unmarkierte Terminatoren
b) Unmarkierte Primer und dye-Terminatoren
Die Produkte der Reaktion werden dann mittels
Kapillarelektrophorese aufgetrennt.
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
13
Molekulare Diagnostik
Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente
• 1. Sequenz:
WT homozygot
• 2. Sequenz:
SNP homozygot
• 3. Sequenz:
1 Allel mit SNP,
1 Allel ohne Mutation
Sequenz zeigt typischen
Haplotyp, gleich
mehrere SNPs als Block
nebeneinander!!
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
14