Transcript Molekulargenetische Diagnostik  Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik)  monogene Erkrankung (Retinoblastom)  genetisch heterogene Erkrankung (multiple kartilaginäre Exostosen)  DNA-Sequenzanalyse (direkte Diagnostik) (Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom)  MLPA (direkte Diagnostik,

Molekulargenetische Diagnostik
 Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik)
 monogene Erkrankung (Retinoblastom)
 genetisch heterogene Erkrankung
(multiple kartilaginäre Exostosen)
 DNA-Sequenzanalyse (direkte Diagnostik)
(Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom)
 MLPA (direkte Diagnostik, Retinoblastom)
(D. Lohmann) H.-J. Lüdecke
Retinoblastom
Familienanamnese bei Retinoblastom
Familie L.B.
Familie J.W.
Familie L.S.
Erbliches Retinoblastom
Keimbahn
konstitutionell
erste
Mutation
rb X RB
Tumor
zweite
Mutation
RB rb
rb rb
rb
RB
Gameten
Retinoblastomgen
Genomische DNA
1 2
3 6 7
17
18
5´
27
3´
Intron
Exon
Intron
Beispiele für Mutationen in kodierenden Bereichen
Segregation
Indirekte Diagnostik: Segregation gekoppelter Marker
VNTR-Polymorphismus
5´
3´
14801
ggtgtacgtc tatacagggc tatgtataac cgactcctgt ttctcctccc
14851
tgcaaccaca gaaccatcac acacacacac acacacacac acacacacac
14901
acacacacac acacggatac acgcacagat acgctccttt ccacaaatgc
14951
acgcaaaccg ggacgcaaac ccacaactcg agggcttaga ccttcactgc
Intragene VNTR-Loci
5´
3´
D13S153
(RBi2)
... CA ...
... GT ...
n
VNTR-Loci
RB1.20
... CTTT ...
... GAAA ...
n
Genotypisierung
RB1, väterliches Allel
RB1, mütterliches Allel
CA
GT
CA
GT
CTTT
GAAA
20
14
CTTT
GAAA
18
19
Kopplungsphase
RB1, mutiert
4bp
Deletion
Exon 4
CTTT
GAAA
CTTT
GAAA
14
19
Kopplungsphase
Rb1.20Genotyp
15-18
14-20
14-18
14-16
18-20
Kopplungsphase
Rb1.20Genotyp
15-18
14-20
14-18
18-20
14-16
4bp
Deletion
Exon 4
CTTT
GAAA
14
Analyse von VNTR-Loci
5´
3´
PCR
oder
Fragmentlängenanalyse
durch elektrophoretische
Auftrennung
Gelektrophorese
Ladepositionen
–
1
2
3
St.
Längenstandard
500 bp
400 bp
elektrisches Feld
300 bp
190 bp
180 bp
90 bp
+
Polyacrylamidgel
Agarosegel in Elektrophresekammer
Anode (–)
Kathode (+)
Auftragen der Proben
Elektrophoretische Auftrennung
Dokumentation per Videobild
Dokumentation
Genotypisierung
Rb1.20Genotyp
2-4
1-5
1-4
4-5
I-1 I-2 II-2 II-3 III-1
1-3
Familie I
1
1
1
1
Familie I
1-2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
Familie I
1-2
3
2-3
1
3
2-3
3
2-3
3
3
3
3
3
3
Familie I
1-2
3-4
2-3
1-4 2-3
3
3
4
4
2-3
Familie I
1-2
3-4
2-3
3-5
1-4 2-3
3-5
5
5
2-3
Familie I
1-2
3-4
2-3
1-4
2-3
3-5
3-5
2-3
Familie 2
Familie 2
I
II
III
II-1
1
1-3
II-2
1
2-3
II-3
2-3
III-1
1
2
2
3
1-3
Familie 3
3
1-4
4-5
2-4
1-5
2-4
4-4
3-4
1-5
Familie 4
Familie 64
1
I
2-4
3
2
3
2-3
1
II
2
2-4
3-4
4
1-3
1
III
I-1
I-2
II-1
II-2
II-3
II-4
III-1
2-3
2-4
Prädiktive Diagnostik bei
Locusheterogenität
Segregationsanalyse bei
hereditären multiplen cartilaginären
Exostosen (HME)
Hermann-Josef Lüdecke
Lokalisierung der Exostosen
Multiple cartilaginäre Exostosen
 Häufigkeit
1 : 50.000
 Penetranz
 100 %
 autosomal dominant
 genetisch heterogen
• 8q24.1
• 11p11-12
(19p
EXT1
EXT2
EXT3)
Spektrum der Mutationen in EXT1 und EXT2
Wuyts & van Hul, 2000
Kopplungsanalyse
und Segregationsanalyse
mit
EXT1- bzw. EXT2- intragenen
Mikrosatelliten-Markern
genomische Organisation des EXT1-Gens
2 3
1
4
5
6
7 8
9
10
11
AUG
6.0
(A)n
UGA
90D8
65G5
9.0
5.0 1.0 4.0
2.2
6.0
2.2
6.0
46F10
25B8
250 kb
“EXT1“
6.5
4.0
P
1
2
3
4
5
P
GP
P
P
P
Kopplungsphase: EXT2, Allel 2
kein Risiko
Risiko:
M
P
1
2
3
4
Übungsaufgaben
P
P
P
EXT1, Allel 2
kein Risiko für III2
1
2
3
4
1
2
3
P
P
keine Aussage möglich
1
P 2
3
1
P 2
3
1
2
3
4
5
P
P
P
EXT2, Allel 2
Individuum III2 wird erkranken
1
2
3
4
Familie D
I
II
M
EXT1
EXT2
P
?
M
M
P
M
P
P ?
P
M
Fehlen paternaler EXT1-Allele
y935A12
y960B10
y960B10
der(5)
der(5)
5
5
8
der(8)
Sonde: "paint 5"
Sonde: y960B10
Molekulargenetische
Diagnostik durch DNASequenzanalyse
Punktmutationen
THE CAT DID EAT THE RED HAT
THE RAT DID EAT THE RED HAT
THE ATD IDE ATT HER EDH AT
THE CHA TDI DEA TTH ERE DHA T
1. Enzymatische Vermehrung des zu untersuchenden
Genabschnittes mittels PCR
Cave: Es werden immer das maternale und paternale gemeinsam amplifiziert!
2. Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
Template (Matrize)
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
Primer (Startmolekül)
5'-AAGTCATTGC-3'
Primer-Annealing (Anlagerung)
5'-AAGTCATTGC-3'
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
DNA-Polymerase
dNTPs
ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Primer-Verlängerung und Kettenabbruch
Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
Template (Matrize, einzelsträngig)
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
Primer (Startmolekül)
5'-AAGTCATTGC-3'
Primer-Annealing (Anlagerung)
5'-AAGTCATTGC-3'
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
DNA-Polymerase
dNTPs
ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Primer-Verlängerung und Kettenabbruch
5'-AAGTCATTGCTACGTAACT
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
5'-AAGTCATTGCTACGTAACTG
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGA
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGAC
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
hier sind einmal alle Produkte der Primer-Verlängerung gezeigt:
5'-AAGTCATTGC-3'
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
DNA-Polymerase
dNTPs
ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Primer-Verlängerung und Kettenabbruch
5'-AAGTCATTGCT
5'-AAGTCATTGCTA
5'-AAGTCATTGCTAC
5'-AAGTCATTGCTACG
5'-AAGTCATTGCTACGT
5'-AAGTCATTGCTACGTA
5'-AAGTCATTGCTACGTAA
5'-AAGTCATTGCTACGTAAC
5'-AAGTCATTGCTACGTAACT
5'-AAGTCATTGCTACGTAACTG
5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGA
usw.
Gelelektrophorese
Kapillarelektrophorese
manuelle Beladung der Gele
automatische Beladung der Kapillaren
Patient
AGCTATAATTGTCAGTTCTGTGACTTCNGATATTCCAAAAGC
CGA
TGA
Normalperson
AGCTATAATTGTCAGTTCTGTGACTTCCGATATTCCAAAAGC
Tricho-Rhino-Phalangeale Syndrome
8
Klinische Zeichen:
TRPS1
EXT1
•
•
•
•
•
•
•
•
•
dünnes, spärliches Kopfhaar
große, "birnenförmige" Nase
langes, flaches Philtrum
schmales Oberlippenrot
Zapfenepiphysen
Brachydaktylie
Hüftveränderungen
Kleinwuchs
multiple cartilaginäre Exostosen
(nur TRPS II)
Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom
An dieser Stelle wurde im Praktikum das Foto einer
Patientin gezeigt. Dieses darf jedoch nicht im Internet
veröffentlicht werden. Ich hoffe, Sie haben sich die
Charakteristika des TRPS einprägen können.
Struktur des TRPS1 Transkriptionsfaktors
N
3
4
5
6
Exon 6
7
C
Sequenzierung von Exon 6 des TRPS1-Gens
CGA  CAA; Arg  Gln; R  Q
Übungsaufgaben
Patient 1
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGNCCACAAAGACCTCTC
ACC
CCC
Normalperson
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGACCACAAAGACCTCTC
Patient 1
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGNCCACAAAGACCTCTC
A C C = Thr
C C C = Pro
Normalperson
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGACCACAAAGACCTCTC
Struktur des Zinkfingers vom "GATA"-Typ
R
P
NH2
W
L
S
T
K
T
T
L
C
N
A
C
RRRGSGVF
K
N
A
N
G
G
Y
V
C
N
Zn
A
C
GLYQKLHS
COOH
aus: Vilain et al. (1999) Am J Med Genet 85:495-497
Patient 2
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTNGGNCCATTGNCNN
Normalperson
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTG
Patient 2
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTNGGNCCATTGNCNN
Wildtyp: G T G C C A A T T G C C TG
mutant: T G T G C C A A T T G C C T
Normalperson
T-Insertion
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTG
Patient 3
CTCTGGCGAAAGAATGCAAATGGCGGATANGTATGCAACGCGT
TAT
T A A = Stop
Normalperson
CTCTGGCGAAAGAATGCAAATGGCGGATATGTATGCAACGCGT
Patient 4
AAGCTTCACTCGNTAAGAACTTGTTCCACTCTTTCAGGAAAA
gtaaga
ttaaga
Normalperson
AAGCTTCACTCGGTAAGAACTTGTTCCACTCTTTCAGGAAAA
RNA - Spleissen
Wildtyp
Mutation eines Spleiss-Signals
Wildtyp-TRPS1
N
3
4
5
6
C
7
1281 aa
IVS6+1G>T  exon6-TRPS1
N
3
4
5
C
7
1240 aa
Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplication (MLPA)
SALSA MLPA probes
Hybridisierung
1.
2.
Der MLPA Sondenmix wird zu denaturierter
genomischer DNA gegeben
Die zwei Teile jeder Sonde hybridisieren mit
benachbarten Zielsequenzen
Beachte den Unterschied
Ligation
3.
Die Sonden werden mit Hilfe einer thermostabilen
Ligase verbunden (ligiert)
Amplification
4.
Mit einem universellen Primerpaar kann man alle
ligierten Sonden amplifizieren
Das Amplifikationsprodukt jeder einzelnen Sonde
hat eine genau definierte Länge (92 - 481 bp).
Fluoreszenzfarbstoff
bp
NP1
NP2
Patient 1
Patient 2
Patient 3
1
10
20
30
40