Transcript Western Blot Ist die Bezeichnung für eine Methode, bei der

Molekulare Diagnostik
WESTERN BLOT
http://www.wiley.co.uk/reecegenes/animations.html
Ist die Bezeichnung für eine Methode,
bei der elektrophoretisch aufgetrennte
Proteine aus einem Trenngel auf ein
Trägermaterial übertragen werden um
dann z.B. mittels Antikörper nachgewiesen
zu werden.
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
1
Molekulare Diagnostik
„Although gel electrophoresis
is a relatively simple
technique, it is not a trivial
procedure.“
David E. Garfin, Electrophoretic Methods
(even more true for blotting...)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
2
Molekulare Diagnostik
Nachweis von Proteinen aus
•
•
•
•
•
Blut (z.B. Virusinfektion, Schwangerschaftstest)
Zellen
Geweben
Harn ( Blasenentzündung)
Lebensmittel (Toxine)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
3
Molekulare Diagnostik
Übersicht
1. Probenvorbereitung
2. Elektrophorese
3. Blotting
4. Nachweis
4.1 Blockierung
4.2 Bindung primärer Antikörper
4.3 Waschschritte
4.4 Bindung sekundärer Antikörper
4.5 Waschschritte
4.6 Substratreaktion
5. Kontrollen
6. Weitere Tipps
Anhang
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
4
Molekulare Diagnostik
Probenvorbereitung
• Bestimmung der Proteinmenge mittels verschiedener
Messmethoden möglich
1.) Bradford
2.) Biuret
3.) Christian Warburg (photometrische
Differenzmessung)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
5
Molekulare Diagnostik
Bradford (Comassie Blue)
•
•
•
Triphenylfarbstoff
Absorptionsmax 465 nm (Rot)
WW mit Protein in saurer Lösung
Absmax shiftet zu 595 nm (Blau):
Farbänderung durch Stabilisierung des Farbstoff-Anions mittels
hydrophober und ionischer WW mit dem Protein
Farbstoff reagiert mit
Arginin!!!
Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin
•
•
•
•
•
Messbereich 0,2-1,5 mg/ml
Ungeeignet für kleine basische Polypeptide
Detergenzien über 0,2 % stören die Messung (NaOH, SDS)
Globulin für Eichgerade geeignet
Nachteil: destruktiv!!!
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
6
Molekulare Diagnostik
Biuret
•
•
•
•
•
Biuret Reagenz enthält CuSO4 in alkalischer Lösung
Cu++ Ionen bilden mit den Peptidbindungen einen blauen Komplex
Messung bei 546 nm
Messbereich 1-10 mg/ml
Nachteil: destruktiv
Warburg-Christian
•
•
•
•
•
•
Proteine zeigen im UV ein Maximum bei 280nm (Tryptophan und Tyrosin)
2. Max. bei 200nm, Peptidbindung und einige AA
Nukleinsäuren zeigen Max. bei 260 nm
Berechnung: 1,55*E (280)-0,76*E(260)=mg/ml
Messbereich 1-10 mg/ml
Vorteil: Proteine werden nicht zerstört und können für weitere Analysen
verwendet werden.
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
7
Molekulare Diagnostik
Probenvorbereitung
• (Bestimmung der Proteinmenge)
• Denaturierung der Proteine
•
•
•
•
1% SDS (Sodiumdodecylsulfat)
Harnstoff
Mercaptoethanol
Dithiothreitol
andere SH-Verbindungen
Erhitzen der Proteine (5-10 min auf 95°C)
Einfärben der aufzutragenden Probe mit Comassie Blue
Etwa 15-25 µg Protein/slot auftragen
1µg Protein/Bande damit Bande sichtbar ist!
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
8
Molekulare Diagnostik
Elektrophorese
• Trägermaterialien
Papier
Acetatfolien
Agarose
Polyacrylamidgel
• Polyacrylamidgel (PAGE)
Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine abhängig von:
unterschiedlicher Ladung
unterschiedlicher Molekulargewichte
Porengröße des Gels (6%-15%)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
9
Molekulare Diagnostik
SDS (Sodium dodecyl sulfate)
• Anionisches Detergens
• Bewirkt folgendes:
Ladungsunterschiede werden aufgehoben
Wasserstoffbrücken gespalten
hydrophobe WW werden aufgehoben
Aggregatbildungen von Proteinen verhindert
Polypeptidfäden werden gestreckt
Proteine aus Untereinheiten werden zu Monomeren
• Proteine binden SDS in konstantem Verhältnis
mit Disulfidbrücken: 70-100%
ohne Disulfidbrücken: 140%
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
10
Molekulare Diagnostik
SDS Gelsysteme
•
•
•
•
Eindimensionale Gele
Einheitliches Gelsystem (kontinuierliches Gel)
Lämmli Gel (diskontinuierliches Gel)
Sammelgel zum Konzentrieren der Proben
Trenngel
Gradientengele (Porengröße ändert sich linear oder exp)
Mischgele (aus Polyacrylamid und Agarose)
Zweidimensionale Gele
• O´Farrell Gele:
1. Dimension: Auftrennung nach ieP
2. Dimension: SDS PAGE
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
11
Molekulare Diagnostik
Kontinuierliches Puffersystem
• Gleiche Puffer für das ganze Elektrophoresesystem
• Einheitliches Polyacrylamidgel
• Nachteil:
Proben müssen hochkonzentriert sein
geringe Probenvolumina
jede Bande ist so breit wie aufgetragene Probenbande
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
12
Molekulare Diagnostik
Diskontinuierliches Puffersystem
• Verschiedene Puffer um pH-Gradienten und Spannungsgradienten
zu erzeugen
• Stabilisierung der Puffer durch verschiedene
Polyacrylamidschichten:
Sammelgel (weitporig, geringvernetzt)
Trenngel (engmaschig, Auftrennung der Proteine
nach Größe)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
13
Molekulare Diagnostik
Trenngel
• Auftrennung im Trenngel allein nach Größe des Proteins
• Nicht vergessen: Standard für Eichgerade!!!
• Achtung: monomeres Acrylamid ist hochgiftig!!!
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
14
Molekulare Diagnostik
Färben der Gele
• Zur Sichtbarmachung der Proteinbanden
• Zur Kontrolle ob die Proteine gut gelaufen sind
• Zur Kontrolle ob gleiche Mengen an Protein aufgetragen wurde.
Entfärben der Gele
• Damit Gel zum Blotten verwendet werden kann
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
15
Molekulare Diagnostik
Trouble Shooting:
Elektrophorese
• Prozentigkeit der Gele auf die Proteingröße
abstimmen, evtl. Gradientengel probieren
– 7,5 % Gele 40 – 200 kDa
– 10 % Gele 30 – 100 kDa
– 12 % Gele 15 – 90 kDa
– 15 % Gele 10 – 70 kDa
(Werte für SDS-PAGE)
• Gellösungen partikelfrei; Salze komplett gelöst
• Gel luftblasenfrei gießen
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
16
Molekulare Diagnostik
Trouble Shooting: Elektrophorese
• Slots vorspülen (Gelbruchstücke/Salze)!
• Gleiche Gesamtvolumina und möglichst
gleiche Proteinmengen auftragen
• Falls möglich Positivkontrolle mitlaufen
lassen (gereinigtes Protein; positiver Extrakt)
• Gel nicht zu schnell fahren, sonst smile-Effekt
(Wärmeentwicklung!)
• Große Gele kühlen
• Nach Elektrophorese eine Standardlane mit
Coomassie anfärben
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
17
Molekulare Diagnostik
Blotten
• Übertragung der Proteine von Gel auf Nitrocellulose (PVDF)
Produktion einer Kopie des Gel, wobei die Proteine auf dem
Filter immobilisiert werden.
• Trennmuster bleibt am Filter erhalten
• Nachdem welches Gel benutzt wurde, Erhaltung der
Immunreaktivität
Funktionellen Aktivität (z.B. Enzymaktivität)
• Nach Transfer mögliche Behandlung der Proteine mit:
Liganden
Antikörper
Enzymsubstraten
• Präparative Reinigung des Proteins möglich (durch Ablösen von der
Transfermembran)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
18
Molekulare Diagnostik
Vorteile des Blottens
•
•
•
•
Qualitative Bestimmung des Proteins
Quantitative Bestimmung des Proteins
Präparative Reinigung
Indentifizierung (z.B. mittels Antikörper: Immunoblotting)
direkter Nachweis
Enzym konjugierte Antikörper (HRP, ß-Gal..)
anders markierte Antikörper (Gold, Biotin,
Luminiszenz)
indirekter Nachweis
ein bereits gebundener, spezif. Antikörper wird
durch einen Sekundärantikörper (ebenfalls
markiert) nachgewiesen.
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
19
Molekulare Diagnostik
Bestimmung der Transfereffizienz
– Anfärben des Gels mit Coomassie Blau
oder Silber (=> nicht geblottete Proteine)
– Anfärben einer Referenzspur der Membran
mit
• Ponceau S Rot (schnell, aber nicht sehr
sensitiv)
• Amidoschwarz (2-5fach sensitiver als Ponceau)
• India Ink
• Coomassieblau (nur für PVDF empfohlen)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
20
Molekulare Diagnostik
Protein-Nachweis: Blockierung
• Blockierungsreagenzien (in TBS oder PBS):
–
–
–
–
–
–
–
Milchpulver (fettarm, 1 – 5 %)
BSA (3 – 5 %)
Casein (1 - 3% für NC, 0,5 – 1,0 % für PVDF)
Ovalbumin (1 %)
Gelatine (3 %, nur NC)
0,05 – 0,1 % Tween 20 (nur PVDF)
Wenn Antikörper gegen Phosphorelierungen eingesetzt
werden kein BSA oder Milchpulver verwenden
• Mind. 0,3 ml Blockierungslösung pro cm² Membran;
für 1 h bei RT (oder ÜN 4°C)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
21
Molekulare Diagnostik
Bindung primärer Antikörper
• 0,5 – 10 µg/ml primärer AK in
Blockierungslösung verdünnen (0,3 ml/cm²
Membran) – optimale Konzentration des
AK austesten (Kompromiss zwischen
Signalstärke und Hintergrund)!
• 1 (– 2) Stunden inkubieren, je nach
Affinität und Konzentration des AK
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
22
Molekulare Diagnostik
Waschschritte
• Abhängig von der Affinität des AK und
auch der Spezifität kann/muss mehr
oder weniger stark gewaschen werden
– Polyklonale Seren sind weniger anfällig
gegenüber zu starkem Waschen
– Monoklonale Seren zeigen weniger
Kreuzreaktivitäten
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
23
Molekulare Diagnostik
Bindung sekundärer Antikörper
• Vom Hersteller empfohlene
Konzentration vom sek. AK in
Blockierungslösung einsetzen (mind.
0,3 ml/cm² Membran)
• 0,5 - 1 Stunde inkubieren
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
24
Molekulare Diagnostik
Substratreaktion
• Meerrettich-Peroxidase (HRP)
– Sehr schnelle Reaktion; nimmt schnell ab
• Alkalische Phosphatase (AP)
– Reaktion beginnt langsamer, hält dafür
länger an; ist insgesamt stärker
• Chemoluminineszenz ca. 10fach
sensitiver als Colorimetrie
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
25
Molekulare Diagnostik
Vergleich HRP – AP
Chemolumineszenz
a) AP-Substratblatt
b) AP-Substrat flüssig
c) HRP-Substrat
Die Fläche unter der
Kurve ist proportional
zur Schwärzung des
Films!
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
26
Molekulare Diagnostik
Summary-Western Blot
• Technik zum Nachweis von Proteinen
Qualitativ
Quantitativ
Präparativ
• Häufige Anwendung in der Diagnostik
Viren
Bakterien
Allergene
Hormone
• Einfache Methode
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Dr. Juliane Strauss
27