Transcript ELISA (Emzyme-linked-immunoSorbent Assay)

Molekulare Diagnostik
Immunoassays
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/ELISA.html
• Fanden erstmal in den 50er Jahren Verwendung
• Zuerst nur radioaktive Markierungen für Immunoassays
• Ab den 70er Jahren auch nicht-radioaktive Assays
• Klassifizierung der Immunoassays wie folgt:
RIA (RadioImmunoAssay)
IRMA (ImmunoRadioMetricAssay)
FIA (FloureszentImmunoAssay)
ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay)
EIA (EnzymeImmunoAssay)
ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)
Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria
Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss
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Molekulare Diagnostik
Definition
• Antigen
– vom Körper als fremd erkannter Stoff, der
eine Reaktion des Immunsystems auslöst
• Antikörper
– die von B-Lymphozyten u. Plasmazellen als
Reaktion auf ein Antigen gebildeten
Immunglobuline
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Molekulare Diagnostik
RIA (RadioImmunoAssay)
Markiertes Antigen tritt in Kompetition mit
unmarkiertem Antigen (zu analysierende Probe)
um Bindungsstelle am Antikörper. Signal ist
indirekt proportional der Konzentration vom
unmarkierten Antigen.
FIA (FloureszentImmunoAssay)
Analog RIA, aber floureszenzmarkiert.
EIA (EnzymeImmunoAssay)
Analog RIA, aber enzymmarkiert.
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Molekulare Diagnostik
IRMA (ImmunoRadioMetricAssay)
Markierte Antikörper binden an Antigen, Signal ist damit
direkt proportional der Konzentration von Antigen in der
zu analysierenden Probe.
ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay)
Analog IRMA, aber luminiszenzmarkiert.
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Molekulare Diagnostik
ELISA
(EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay)
Durch Festphasenkopplung technisch bedeutend
vereinfachter EIA
Dient dem Nachweis von
Antigenen
Antikörpern
Haptenen
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Molekulare Diagnostik
ELISA: Prinzip Sandwich
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Festphasen gekoppelter AK (erster AK)
Nachzuweisendes Antigen bindet an diesen 1. AK
Antigen wird mittels Enzym markiertem AK (2. AK) nachgewiesen
Als Enzyme dienen
HRP (HorseRadishPeroxidase)
Alkalische Phosphatase
• Gebundene Enzymaktivität wird über Substratumsatz vermessen
• Substrat wird gemeinsam mit löslichem Chromogen angeboten (dieses
ist anfänglich farblos und wird durch den Substrat-umsatz zu int.
gefärbter, spektroskop. auswertbarer Form)
• Direkte Proportionalität zw. unbekannter Probe und Farbumsatz
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Molekulare Diagnostik
Elisa-Sandwich-Testprinzip
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Molekulare Diagnostik
Kompetitiver ELISA
• Hauptsächlich zum Nachweis von Haptenen wie Steroidhormonen (sind
zu klein um zwei AK zu binden)
Feste Phase wird/ist mit AK beschichtet
Zugabe von Tracer und Hapten (unbekannte Probe)
-Tracer = enzymmarkiertes Hapten, wird zu
jeder Probe in gleicher Menge beigegeben.
-Umso mehr nachzuweisendes Hapten in der
Probe ist, umso weniger Tracer wird an die
Festphase gebunden (Kompetition).
Substratzugabe
Tracer setzt Substrat zu Farbstoff um. Umso weniger
Tracer umso weniger Farbumsatz, umso mehr Hapten
ist in der Probe.
• Farbe und Probenmenge sind indirekt proportional!!!!
• Nachteil: Überschuß an Tracer wirkt sich negativ auf Empfindlichkeit aus!!
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Molekulare Diagnostik
Kompetitiver Immunoassay
Farbsignal ist indirekt proportional der Antigenkonzentration
Meist bei Haptenen verwendet, da diese zu klein sind um zwei
Antikörper zu binden
Vorsicht: Überschuß an Tracer verfälscht das Ergebnis!!
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Molekulare Diagnostik
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Blut:
Beispiele
HIV1 und HIV2 (Anwesenheit von Anti-HIV Antikörper)
Hepatitis C (Anwesenheit von Antikörpern)
Hepatitis B (Nachweis von Antikörper und viralem Antigen)
Hormone:
Schwangerschaftshormon
LH (Bestimmung des Eisprungs)
TSH, T3 und T4 (Thyroidfunktion)
Anabol. Steroide, Sportler: Doping Test
Infektionsdetektion
Sexuell übertragbare Erreger (HIV, Syphilis, Chlamydien)
Hepatitis B und C
Toxoplasmose
Allergene in Lebensmittel und Hausstaub
Rheumatische Faktoren (Autoimmunantikörper)
Toxine im Essen
Drogen: Kokain, Opiate, Marihuana (9-Tatrahydrocannabinol)
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