Transcript PEC - Free

Université de Reims
Champagne Ardenne
EA3801
CHU de Reims
Différenciation endothéliale et
processus angiogéniques
Pr Philippe NGUYEN
EA3801 et Laboratoire d’Hématologie
Cellule endothéliale
1 à 6 10 13 cellules
Poids total : 1 kg
Surface : 1 à 7 m2
Cellules aplaties
(L:100 µm-l:10 µm
Épaisseur :0,3 µm)
disposées en mosaïque
-
Corps de Weibel Palade (ME)
Facteur Willebrand
PECAM1 (CD31) / VE-Cadhérine (CD144)
Synthèse de NO (eNOS)
JAMS/Esélectine/VEGFR2
Angiogénèse
ANGIOGENESE POST-EMBRYONNAIRE, NON TUMORALE :
• angiogénèse : prolifération capillaire, favorisant le flux sanguin
• vasculogénèse : à partir de progéniteurs endothéliaux
• artériogénèse : développement des réseaux collatéraux (résistance)
Différenciation
Hypoxie
Migration / Prolifération
HIF-1a
Facteurs de croissance/Cytokines
VEGF, FGF, IGF…
• Cellule progénitrice endothélial :
– endothelial progenitor cell (PEC)
– Différenciation et acquisition d’un phénotype
endothélial à partir d’une cellule souche
hématopoïétique CD34+ [Asahara, 1997]
– Circulating bone marrow-derived endothelium
progenitor cells (CEPCs) [Rafii, 1998] :
• CD34+
• Marqueurs phénotypiques : facteur von
Willebrand, Dil-Ac-LDL.
Isolement des cellules CD34+
Sang de cordon
1. Isolement des PBMC
2. Élimination des cellules
adhérentes
3.Tri immuno-magnétique des cellules CD34 positives
4.Mise en culture dans des « conditions endothéliales » (VEGF …)
Modèle de différentiation des cellules CD34+ en progéniteurs
endothéliaux (PEC)
J0
Cellule souche
CD34+
J25-30
Facteurs de
croissance
(VEGF…)
Progéniteurs
endothéliaux
Analyse de l’expression membranaire et moléculaire à différent
temps de la différenciation:
VEGF, VEGFR1,VEGFR2,CD144(VE-cadhérine), et FT
Caractérisation des PEC
• Culture cellulaire
– À partir de sang de cordon, de sang périphérique
– Support :
• gélatine, fibronectine, collagène de type I
– Facteurs de croissance :
• VEGF, IGF-1, EGF, FGF-B
précoces
– Temps d’obtention
– Aspect des colonies :
• Cellules adhérentes « spindle shaped »
• Tapis de cellules fusiformes
tardives
Phénotype des PEC
• CD133 (AC133) :
– Exprimé par la CSH
– Absent de la cellule endothéliale mature et du
monocyte
– Différenciation endothéliale in vitro
• CD34 :
– marqueur de cellule souche hématopoïétique
– Présent (faible expression) sur la cellule
endothéliale mature
• VEGF-R2 (KDR) :
– Marqueur endothélial
Phénotypage des PEC par cytométrie en flux
CD34
HUVEC
CD34
EPC
HUVEC
Count
Count
EPC
CD34
VEGFR2
CD34 : PBMC de sang de cordon
PEC : en milieu de culture adapté
HUVEC : Cellules endothéliales matures
EA3801
Origine (multiple) des précurseurs
endothéliaux
Hémangioblaste
HSC
Progéniteurs Myéloïdes
Progéniteurs Endothéliaux
Monocyte
Progéniteurs endothéliaux circulants
Monocyte
CD14+
CD34+
PEC
PEC
CD14+,CD34low, KDR+
CD34+, CD133+, KDR+
Sous-type myéloïde
« True angioblast »
Leri, Circ Res 2005
Origine et différenciation des progéniteurs
endothéliaux, d’après Dimmeler, 2004.
Caractérisation des PEC
•
•
•
•
•
Mesure de la prolifération
Expansion
Migration cellulaire
Formation de tubes : (Matrigel)
Activité paracrine :
X
40
– synthèse de facteurs de croissance : VEGF, HGF, G-CSF,
GM-CSF
• Modèles animaux :
– Implant de Matrigel
– Modèle d’ischémie de la patte (ligature de l’artère
fémorale)
Rehman, 2003 ; Hur, 2004
Sources possibles de cellules endothéliales
– Cellules souches : CSH, cellules souches
« cardiaques », cellules souches
mésenchymateuses,
– Cellules myéloïdes :
• CD14+/VEGF-R2+ CD34-/CD133- :
• Acquisition de marqueurs endothéliaux phénotypiques
• Formation de tubes in vitro
– Cellules endothéliales matures :
• shedding vasculaire
Mobilisation des « PEC »
Moelle osseuse
Cellules stromales médullaires
cKit+
MMP-9
mKitL
Hémangioblaste
sKitL
Barrière endothéliale
Sang
PEC circulants
Précurseur hématopoïétique
circulants
D’après Hristov, 2003
Mobilisation des PEC
• Micro-environnement, « niches » :
– Fibroblastes, ostéoblastes, cellules endothéliales
• Protéinases :
– Élastase, cathepsine G, métalloprotéinases matricielles
(MMP)
– Clivage de mkitL (kit ligand membranaire) par MMP-9
• Facteurs de croissance
– G-CSF, GM-CSF, EPO
– SDF-1, VEGF, angiopoïétine
Processus de réparation endothéliale par les PEC
Cellule endothéliale
Circulante (CEC)
PEC
CD146 +
CD31 +
vWF+
intégration
CE
CML
Transdifférenciation
Matrice extracellulaire
D’après Hristov, 2003
Comparaison CEC versus PEC
PEC
CEC
• Cellule mature, provenant
de la paroi vasculaire
• Témoin d’une lésion
vasculaire
• Expression de marqueurs
endothéliaux : CD146,
vWF, CD31…
• Pas d’expression des
marqueurs CD45/CD133
• Pas de potentiel
clonogénique
20 cellules/mL
• Progéniteur
• Témoin d’une lésion
vasculaire ? D’une
régénération ?
• Faible expression de
CD146, CD31
• Faible expression de
CD45, expression de
CD133
• Potentiel clonogénique
Dimmeler, 2004
Différents phénotypes endothéliaux
• Cellule « tip »
–
–
–
–
Leader
Filopodes étendus
Signaux de direction
Migration à travers la matrice
extracellulaire
• Cellule « stalk »
– Prolifération
– Vacuoles créant la lumière
vasculaire
– Produit la matrice
• Cellule « phalanx »
–
–
–
–
Devient quiescent
Monocouche
Jonctions serrées
Contact avec le péricyte
Induction et déstabilisation de la paroi capillaire
• Induction par hypoxie
– HIF : complexe hétérodimérique sensible à l’hypoxie
– En hypoxie : dimérisation et activation des gènes
cibles (HRE : promoteurs)
• Déstabilisation de la paroi capillaire : sortie de la
quiescence endothéliale
– NO libéré lors de l’hypoxie : favorise la perméabilité
induite par le VEGF
– VEGF : VEGF-R2 : activité tyrosine kinase
(MAPK/PI3K)
– Angiopoiétines
Facteurs de croissance angiogéniques
• VEGF
– Effet via les récepteurs VEGF-R1 (flt-1) et VEGF-R2 (flk/KDR) :
activité tyrosine kinase
– Favorise la migration et la prolifération endothéliale
– Augmente la perméabilité vasculaire
• Angiopoïétine-1
–
–
–
–
–
Effet via le récepteur Tie2 (tyrosine kinase)
Effet sur l’engagement des précurseurs endothéliaux
Effet sur la migration endothéliale
Pas d’effet sur la prolifération endothéliale
Recrutement des péricytes
• Angiopoïétine-2
– Expansion cellulaire
• b-FGF
– Anti-apoptotique, activation d’Akt
Inhibiteurs de l’angiogénèse
• Angiostatine
– 38 kDa, 3 kringles
– Générée par protéolyse du plasminogène par métallo-élastases
et MMP
– Induit l’apoptose des cellules endothéliales
– Inhibe la prolifération endothéliale
• Endostatine
– 20kDa, fragment du collagène XVIII (cathépsine L, élastase)
– Inhibition de la migration endothéliale (dépendant de eNOS)
– Pro-apoptotique (réduction de Bcl-2, Bcl-XL)
• Thrombospondine-1
– Glycoprotéine haut poids moléculaire
– Ligand de CD36
– Pro-apoptotique (p38-MAPK : activation des caspases)
Progéniteurs de la cellule endothéliale
Source
Procédé
d’isolement
Marqueurs
cellulaires
Moelle osseuse
Microbilles CD133+
CD146-, CD133+,
CD31-, vWF-,VEcadhérine -
Sang de cordon
Microbilles CD34+
CD133+
Sang périphérique Microbilles CD34+
CD133+ ou CD133-
Adhésion PBMC
CD146 : marqueur de la cellule endothéliale circulante
Identification des PEC dans un produit de thérapie
cellulaire
EA 3801
Identification des PEC dans un produit de thérapie cellulaire
EA 3801