Transcript Umbilikalna krv kao izvor matičnih ćelija

UMBILIKALNA KRV KAO
IZVOR MATIČNIH ĆELIJA
HEMATOPOEZE
Doc. dr Dejan Škorić
MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE



Matične ćelije hematopoeze (MĆH) formiraju zrele
ćelije krvi i imune ćelije.
Pluripotentne MĆH (PMĆH) su nediferentovane
ćelije koje imaju sposobnost samoobnavljanja,
proliferacije, diferencijacije u pravcu raznih
specijalizovanih
ćelija
krvi,
usađivanja
u
odgovarajuću mikrosredinu i mobilizacije iz
kostne srži (KS) u perifernu krv (PK).
PMĆH su veoma retke jer je samo 1 od 10.000 ili
15.000 ćelija sa jedrom u KS pluripotentna MĆH.
U UK 1 od 1000 ćelija sa jedrom je MĆH.
MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE



Pluripotentne MĆH se diferentuju u pluripotentne
progenitore (PP), koji su i dalje pluripotentni, ali sa
redukovanim
potencijalom
samoobnavljanja.
Daljom
diferencijacijom iz njih nastaju pluripotentni mijeloidni
progenitori (PMP) i pluripotentni limfoidni progenitori (PLP).
Od PMP i PLP nastaju progenitori opredeljeni za dve ili samo
jednu lozu. Ovi poslednji se nazivaju opredeljeni
progenitori.
Pluripotentne MĆH i progenitorske ćelije nisu morfološki
prepoznate i jedini morfološki parametar kojim su ove ćelije
definisane je, da pripadaju mononuklearnoj ćelijskoj
subpopulaciji i da su veličine malog limfocita.
Daljom diferencijacijom opredeljenih progenitora nastaju
morfološki
prepoznatljive
ćelije,
koje
se
nazivaju
prekursorske ćelije i iz kojih sazrevanjem nastaju zrele
krvne ćelije (Slika 1).
Fenotip
Testovi
Lin- CD34+
CD38-
CRU/SRC
HLA-DRlow
Thy-1+ c-kit+
CD133+
LTC-IC/CAFC
MCH
HPP-CFC
Lin+/- CD34+
CFU-GEMM
PP, PMP, PLP
CD38+
CFU-GM
CFU-G
CFU-M
BFU-E
CFU-E
CFU-Mk
HLA-DRhigh
Thy-1low
Opredeljeni progenitori
Dendriticne celije
Morfološki pregled
Imunofenotip
Funkcionalni testovi
zrelih celija
Monociti /
makrofagi
Lin+ CD34Granulociti
B-limfociti
NK celije
Eritrociti
T-limfociti
Trombociti
(megakariociti)
Slika 1. Šematski prikaz hematopoeze. Sa leve strane se nalaze uobičajene
kombinacije antigena koje odgovaraju određenom stepenu diferencijacije, a
sa desne strane su prikazani in vivo i in vitro testovi za identifikaciju MĆH,
progenitorskih ćelija i zrelih ćelija krvi (preuzeto iz Lord i sar., Stem Cells,
1997).
Fenotipska identifikacija matičnih
ćelija hematopoeze


Humane pluripotentne i opredeljene MĆH imaju
na svojoj površini CD34 antigen. Ovaj antigen je
prisutan na 1-4% mononuklearnih ćelija (MNĆ)
kostne srži i 1-2% MNĆ umbilikalne krvi (UK);
CD34+ ćelije predstavljaju heterogenu populaciju i
među njima se nalaze: pluripotentne MĆH (oko 15%KS; 10%-UK), progenitorske ćelije (oko 20%)
i nematične ćelije;
IZVORI MATIČNIH ĆELIJA
HEMATOPOEZE

Kostna srž (Thomas i sar., 1957)

Periferna krv (Goldman i sar., 1979)
90% Autolognih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK

Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)
IZVORI MATIČNIH ĆELIJA
HEMATOPOEZE

Kostna srž (Thomas i sar., 1957)

Periferna krv (Goldman i sar., 1979)
90% Autologih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK

Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)
PODELA ALOGENIH TMĆH PREMA VRSTI
DAVAOCA




singene – davalac je identičan
blizanac
alogene od srodnog-podudarnog
davaoca (30%)
alogene od nesrodnog-podudarnog
davaoca (50-80% – KS ili PK)
alogene od nesrodnog-nepodudarnog
davaoca
(15-30% → UK)
UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat)



Gluckman i saradnici su 1988. godine izveli prvu
transplantaciju MĆH iz UK u dečaka sa
Fanconijevom anemijom. Davalac je bila njegova
HLA-podudarna sestra (Gluckman i sar., 1989).
Početkom 90-ih, urađene su prve TMĆH iz UK od
nesrodnih davalaca, a 1992. i 1993. formirane su
prve banke za UK (Njujork, Milano i Diseldorf)
(Rubinstein i sar., 1993).
Krajem 90-ih godina urađeno je nekoliko stotina
TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, a započeto je
i intenzivno korišćenje UK za transplantaciju u
odraslih bolesnika (Laughlin i sar., 2001).
UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat)



U toku 2004. godine, ustanovljeni su kriterijumi
za indikacije i izbor uzoraka UK za TMĆH
(Gluckman i sar., 2004).
U
današnje
vreme
ima
preko
350.000
kriokonzervisanih uzoraka UK, dostupnih za
alogenu TMĆH. Pretraživanje uzoraka UK se vrši
preko Netcord organizacije (Wang i sar., 2009).
Do sada je ukupno urađeno preko 10000 TMĆH iz
UK i oko 20% alogenih TMĆH poslednjih godina
urađeno iz UK (Gluckman i sar., 2010).
Prednosti UK kao izvora MĆH (1)



Umbilikalna krv je neograničeno dostupan izvor
MĆH.
Formiranjem
banaka
za
UK,
potencijalno
neograničen broj uzoraka UK može da se dugotrajno
skladišti u njima;
Nema rizika za davaoce umbilikalne krvi. Ako se
primenjuju uobičajene ginekološke procedure, prikupljanje
UK je potpuno bezbedno po porodilju i novorođenče;
Umbilikalna krv je lako i brzo dostupan izvor MĆH.
Zamrznuti uzorci u bankama za UK su godinama apsolutno
dostupni za TMĆH, dok se godišnje se gubi iz registra
(BMDW) oko milion dobrovoljnih davalaca KS ili PK i to
zbog bolesti, gubitka volje za donaciju ili smrti.
Prednosti UK kao izvora MĆH (2)


Redukovana incidenca i težina GVHD posle TMĆH iz
UK i pored HLA-nepodudarnosti je posledica smanjenog
broja i imunske nezrelosti T limfocita i APĆ. T limfociti su
“devičanski” i (10-1000 puta) manje aloreaktivni od ćelija
iz PK. Smanjena je produkcija Th1 citokina (IL-2 i INF-γ),
što doprinosi smanjenom kapacitetu T limfocita iz UK za
Th1 citotoksični imunski odgovor.
Smanjen rizik od transmisivnih virusnih infekcija.
Novorođenčad se inficiraju CMV i EBV u toku intrauterinog
perioda (transplacentarno) ili perinatalno i infekcije su u
tom uzrastu retke (1%). Inficiranost CMV i EBV je velika
(do 70%) kod starije dece i odraslih osoba.
Nedostaci UK kao izvora MĆH (1)

Uzorci UK imaju manji broj MĆH u odnosu na kalem iz
KS ili PK. Kalem iz KS ima 10 puta više CD34+ ćelija od
prosečnog uzorka UK, a kalem iz PK i do 100 puta više.
Posledice su: povećano je odbacivanje kalema (od 7% do
22%); produženo je vreme potrebno za obnavljanje
granulocitopoeze (N>500/mm3) (od 23 do 33 dana), i
trombocitopoeze (Tr>20.000/mm3) (od 54 do 90 dana) i
povećana je smrtnosti od posledica transplantacije
(transplant related mortality - TRM) (od 20% do 44%) u
odnosu na TMĆH iz KS od nesrodnih, podudarnih davalaca.
Ćelijska doza je najznačajniji
prognozu TMĆH iz UK.
faktor za
Minimalna ćelijska doza za TMĆH iz UK
• Deca: > 3,7 x 107 NĆ/kg
• Odrasli: > 2,0 x 107 NĆ/kg
> 1,7 x 105 CD34+/kg
> 4 x 104 CFU-GM/kg
(Gluckman i sar., 2005)
Nedostaci UK kao izvora MĆH (2)


Uzorci umbilikalne krvi imaju manji broj i redukovanu
funkcionalnu aktivnost limfocita i antigen prezentujućih
ćelija u odnosu na kostnu srž ili perifernu krv. Funkcionalna
nezrelost T limfocita povećeva rizik za nastanak teških
infekcija u ranom posttransplantacionom periodu. Incidenca
potencijalno
fatalnih
infekcija
je
značajno
viša
(sespa=55%) posle TMĆH od nesrodnih davalaca UK.
Umbilikalna krv se može samo jednom prikupljati –
nema mogućnosti da se matične ćelije hematopoeze
ili limfociti ponovo prikupljaju od istog davaoca. U
slučaju recidiva maligne bolesti posle TMĆH iz KS ili PK,
moguće je ponovo prikupiti MĆH ili limfocite od istog
davaoca i primeniti sekundarnu TMĆH (retransplantacija), ili
indukovati antitumorski efekat putem infuzije limfocita
davaoca. UK se prikuplja samo jednom – neposredno posle
rođenja deteta.
Primena UK u alogenoj TMĆH od nesrodnih
davalaca

Ključno pitanje: kakvi su rezultati postignuti u lečenju dece
i odraslih primenom UK u odnosu na KS i PK

Hwang i sar., 2007. godine su objavili izuzetnu
retrospektivnu studiju u kojoj su zaključili:
1.
2.
Od 1124 objavljenih radova samo 6 mogu da se koriste u
komparativnoj analizi WCE i PltE, TRM, aGVHD i cGVHD,
RR, DFS i OS, posle primene UK (0-2 HLA-nepodudarnost)
vs. KS (6/6 HLA-podudarnost);
Produženo je vreme prihvatanja kalema (WCE i PltE) i
povećana je smrtnost od posledica transplantacije, ali je
smanjen procenat relapsa i redukovana je incidenca i
težina aGVHD i cGVHD, posle primene UK u odnosu na KS,
tako da nema statistički značajne razlike u DFS i OS (i za
decu i za odrasle).
Strategije za uvećanje ćelijske doze iz UK

Poboljšanje metodologije prikupljanja i
kriokonzervacije uzoraka UK;

Simultana transplantacija 2 uzorka UK –
dvostruka TMĆH iz UK;

Ex vivo ekspanzija MĆH iz UK;

Primena kondicionog protokola sa
redukovanim dozama radio i/ili
hemioterapije.
Prikupljanje uzoraka UK – određivanje
hematološkog potencijala



Adekvatno prikupljanje UK je neophodno za obezbeđivanje
kvalitetnih uzoraka UK, što podrazumeva uzorke sa što
većim hematološkim potencijalom.
Hematološki potencijal predstavlja sposobnost određenog
kalema da obnovi hematopoezu i posredno se određuje na
osnovu broja NĆ, CD34+ ćelija i opredeljenih progenitorskih
ćelija (CFU-GEMM, CFU-GM i BFU-E).
Harris i saradnici (1994) su u fundamentalnoj studiji
prikazali da, bez obzira na metod prikupljanja UK, broj NĆ
u jednom ml UK je uvek isti. To praktično znači da se
prikupljanjem uzorka sa većom zapreminom, obezbeđuje
veći apsolutni broj NĆ.
Prikupljanje uzoraka UK



Optimalan i opšteprihvatljiv metod prikupljanja UK još uvek
nije ustanovljen.
Dileme i pitanja u vezi procedure: ko (ginekološko osoblje
ili specijalizovani timovi), kada (pre porođaja placente ili
posle porođaja placente; rano klemovanje pupčanika ili
odloženo), kako (putem gravitacije ili nekim drugim
metodom) treba da prikuplja UK da bi dobio kvalitetne
uzorke sa najvećom mogućom zapreminom i bez
kontaminacije sa patogenim agensima i limfocitima
porodilje.
Do sada je postignuta jedino saglasnost u vezi sa
korišćenjem zatvorenih sistema (setova) za prikupljanje i
delimična saglasnost o ranom klemovanju pupčanika posle
porođaja deteta.
Prikupljanje uzoraka UK – metodi
• In utero metod
• Ex utero metod
• Kombinovani metod
In utero metod
Prikupljanje UK in utero metodom se obavlja u toku trećeg
stadijuma porođaja, tj. neposredno po rođenju deteta, a
pre porođaja posteljice. Kese su postavljene ispod nivoa
posteljice, što omogućava oticanje krvi iz posteljice i
pupčanika u kese pod dejstvom gravitacije. Proceduru vrše
ginekolozi ili babice.
Prednosti in utero metoda:

izbegavanje procesa koagulacije UK i stvaranja ugrušaka;

Izbegavanje moguće rupture posteljice i pupčanika u toku
porođaja.
Nedostaci in utreo metoda:
 veća mogućnost bakterijske kontaminacije uzoraka UK;

proceduru obavlja ginekološko osoblje, čija je pažnja više
usmerena na porođaj.
Većina autora je prikazala da je in utero metod efikasniji od
ex utero metoda.
Prikupljanje uzoraka UK-uticaj
ginekoloških faktora



Na zapreminu uzorka UK pored metoda prikupljanja utiču i
ginekološki faktori (Jones i sar., 2003; Askari i sar., 2005;
Solves i sar., 2005; Mancinelli i sar., 2006; George i sar.,
2006).
U svim studijama je potvrđeno da telesna težina
novorođenčeta (TT)
i težina placente (TP) utiču na
zapreminu i broj ćelija, tj. veća TT i TP obezbeđuju uzorke
sa većom zapreminom i brojem ćelija.
Otkriveno je da na zapreminu uzoraka utiče i dužina
pupčanika (duži pupčanik/↑v), broj prethodnih trudnoća
(prvorođeno dete/↑v), gestacijski uzrast (duže trajanje
trudnoće/↑v), način porođaja (Carski rez/↑v) i pol deteta.
Kriokonzervacija uzoraka UK(1)




TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, zahteva efikasne
procedure prikupljanja, obrade i kriokonzervacije (Wall i
sar., 2005).
Namena različitih metoda (protokola) kriokonzervacije je
sprečavanje mogućih oštećenja ćelija tokom procesa
zamrzavanja i odmrzavanja (tzv. kriooštećenja).
Da bi se sprečio nastanak kriooštećenja, neophodno je
odrediti optimalnu brzinu hlađenja i koncentraciju
krioprotektora, jer su to dva glavna faktora koji utiču na
preživljavanje zamrznutih ćelija (Balint i sar., 1999).
Brzina hlađenja može biti kompjuterski kontrolisana
(programirano
zamrzavanje)
ili
nekontrolisana
(neprogramirano zamrzavanje), a od krioprotektora se u
današnje vreme koriste jedino dimetilsulfoksid (DMSO) i
HES (Hunt i sar., 2006).
Kriokonzervacija uzoraka UK(2)



Protokoli kriokonzervacije UK su nastali od protokola
korišćenih za zamrzavanje matičnih ćelija KS i PK;
Prilikom kriokonzervacije kalema iz KS ili PK nije neophodno
da oporavak ćelija bude optimalan, jer obično u kalemu pre
kriokonzervacije ima „višak“ MĆH.
Suprotno od KS i PK, u UK se nalazi inicijalno mali broj
MĆH, tako da je neophodno da kriokonzervacija bude
optimalna, tj. da što je moguće veći broj ćelija preživi
zamrzavanje.
Kriokonzervacija uzoraka UK(3)



Donaldson i saradnici (1996) su prvi objavili komparativnu
studiju u kojoj su vršili kriokonzervaciju uzoraka UK sa
različitim koncentracijama DMSO-a, u kombinaciji sa
različitim brzinama hlađenja.
Zaključili su da je kompjuterski kontrolisana brzina hlađenja
od 1 do 2 ºC/min, kao i koncentracija DMSO-a od 5% do
10%, odgovarajuća za adekvatan oporavak CD34+ ćelija.
Kasnije, u drugim studijama su prikazani oprečni rezultati
oporavka
MĆH
posle
primene
programiranog
ili
neprogramiranog zamrzavanja (Ballatore i sar.,1996;
Shlebak i sar., 1999; Hunt i sar., 2003; Meyer i sar., 2006).
Naša iskustva


Prvi uzorak UK u Srbiji je prikupljen u junu
2000. godine (Škorić, Sinđić, Popović)
Kasnije je prikupljeno preko 100 uzoraka
upotrebom aktivnog i standardnog in
utero metoda






Škorić D., Sinđić M., Balint B., Petakov M., Stojimirović E., Rodić
P., Jovanović N.: Savremene mogućnosti korišćenja umbilikalne
krvi kao izvora za transplantaciju matične ćelije hematopoeze.
Bilt transf 2004, 50(1-2):123-126.
Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.:
Cryopreservation of umbilical cord blood. Bilt transfuziol 2006,
52 (1): 12-16.
Škorić D. Umbilikalna krv kao izvor matičnih ćelija hematopoeze.
Bilt.hetmatol. 2007, 35:27-34.
Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.: Collection
strategies and cryopreservation of umbilical cord blood. Transfus
Med. 2007 Apr;17(2): 107-13
Škorić D., Sindjić M., Balint B., Petakov M., Rodić P. Comparisson
between two different umbilical cord blood collection strategies
while the placenta is still in uterus. Pediatric Blood & Cancer
2006; 47(4):462
Škorić D., Sinđić M., Balint B., Petakov M. and Ivanovski P.
Influence of Obstetric Factors on Quality of Umbilical Cord Blood
Units. Pediatric Blood & Cancer 2008; 51(4):541
DOPRINOS METODOLOGIJI
PRIKUPLJANJA, IZDVAJANJA I
KRIOKONZERVACIJE MATIČNIH ĆELIJA
HEMATOPOEZE IZ UMBILIKALNE KRVI
dr Dejan Škorić
Doktorska disertacija, jun 2007.
Tabela 1. Rezultati prikupljanja UK upotrebom aktivnog
i standardnog in utero metoda
Metod
prikupljanja
Grupa A
Grupa B
Statistička
značajnost
Broj uzoraka
49
50
Zapremina (ml)*
103 ± 35
86 ± 29
p<0,05
Medijana (ml)
97
81
p<0,05
Min. vrednost (ml)
50
51
Max. vrednost (ml)
172
135
Odbačeni uzorci
(%)**
14
36
p<0,01
Bakterijska
kont.(%)
2.04
2.0
NSZ
*Srednja vrednost ± standardna devijacija
**Odbačeni uzorci su manji od 50 ml i/ili imaju manji apsolutni broj NĆ od 8 x 108
NSZ = nema statističke značajnosti
Tabela 2. Protokoli kriokonzervacije mononuklearnih ćelija
umblikalne krvi
PROTOKOL
KRIOPROTEKTOR
ZAMRZAVANJE
Protokol 1
10% DMSO
Programirano
Protokol 2
10% DMSO
Neprogramirano
Protokol 3
5% DMSO
Programirano
Protokol 4
5% DMSO
Neprogramirano
20
I
10
Vreme (min)
II
Temperatura (ºC)
50
40
30
20
0
10
0
III
-10
-20
-30
IV
-40
-50
-60
V
-70
Grafikon 1. Procedura programiranog zamrzavanja se sastoji od 5 faza:
I = 5°C/min, 4 minuta ;
II = 0°C/min, 5 minuta (ekvilibracija);
III = 2°C/min, 5 minuta;
IV = 1°C/min, 35 minuta;
V = 5°C/min, 5 minuta.
Tabela 2. Uticaj ginekoških faktora na kvalitet
uzoraka umbilikalne krvi (TT i TP)
(broj uzorka =
62)
TT (2500g −
3300g); TP
(600g − 700g)
(broj uzoraka
= 37)
Zapremina (ml)
*
96 ± 35
74 ± 22
p<0,05
NĆ* (x10/8)
12,5 ± 5,3
9,2 ± 5,7
p<0,05
CD34+* (x
10/6)
3,9 ± 1,4
2,9 ± 1,2
p<0,05
CFU-GM*
(x10/4)
104,1 ± 24,7
64,3 ± 18,5
p<0,01
TT > 3300 g;
TP > 700g
*srednja vrednost ± standardna devijacija (SD)
Rezultati postignuti u našem istraživanju stvorili
su
tehničko-manipulativne
preduslove
za
prikupljanje, izdvajanje i kriokonzervaciju
umbilikalne krvi. Ovi preduslovi su neophodni
za formiranje javne/nacionalne banke za UK u
Srbiji, koja bi omogućila savremeno lečenje
bolesnika u kojih je neophodna transplantacija
matičnih ćelija hematopoeze od nesrodnih
davalaca.