Transcript 七、肿瘤侵袭转移及干预研究

Cancer
Invasion
&
Metastasis
Liver Metastasis of Lung Cancer
主要内容
一、概述
二、侵袭、转移的定义
三、癌转移的条件及特点
四、肿瘤转移过程
五、肿瘤转移的分子机制
什么是转移？
• 肿瘤侵袭（Invasion)
– 是指恶性肿瘤细胞离开原发灶而侵
犯邻近组织并继续增殖的过程。
侵袭包括四个过程
◆肿瘤细胞的增殖
◆肿瘤从原发灶脱离—E-钙粘连素下
降
◆肿瘤细胞的运动性和趋化性
◆血管生成与肿瘤侵袭
◆肿瘤细胞的增殖
Ki67是一种增殖相关核抗原，检测其表达能特异性识别增
殖的肿瘤或正常细胞。反映细胞增殖活性的Ki 67指数
(Ki67 LI)可作为判断肿瘤生长速度的指标。研究发现，
传统的反映肿瘤侵袭能
力的形态学标志(如核多形性、细胞不典型性和有丝
分裂活跃等)，与垂体腺瘤增殖和侵袭性相关性较低。
而肿瘤生长速度则被认为是反映垂体腺瘤侵袭性的
客观指标
这与其具有高增殖性及高侵袭性有关。本实验应用腺病
毒作为载体介导抑癌基因PTEN体外转染人脑胶质瘤细
胞U87，检测其细胞增殖力与体外侵袭力的改变，进而探
讨PTEN作为胶质瘤基因治疗靶点的可能性。
肿瘤转移(Metastasis)
– 是恶性肿瘤细胞脱离原发部位，通过
各种渠道转运到不连续的靶组织中继
续增殖，形成同样性质肿瘤的过程。
•远隔部位继发瘤形成
•继发瘤继续生长
•继发瘤再侵袭转移
• 人类对肿瘤侵袭转移的认识
–肿瘤是高度异质性的细胞群体
–转移是一个多步骤、序贯的复杂
过程
–转移的发生是多因素相互作用的
结果
（Fidler,IJ Surgical Oncology Clinics of North
America. 2001，10（2）：257-269）
转移有什么特点？
肿瘤转移特点
1. 不同肿瘤其转移能力有差异
低转移 基底细胞癌、脊髓瘤、
液腺腺样囊性癌、软骨肉瘤、
高转移 甲状腺滤泡型腺癌、黑
色素瘤
唾
2. 不同类型肿瘤其转移途径不同
淋巴道转移 癌 如肺癌、
NPC
血道转移
肉瘤、绒癌、肾癌
前列腺癌等
3. 转移的器官特异性
原发瘤
乳腺癌
前列腺癌
肺小细胞癌
甲状腺癌
肾癌
膀胱癌
睾丸癌
……
转移器官
骨、脑、肾上腺
骨
骨、脑、肝
骨
骨、肝、甲状腺
脑
肝
“Seed and Soil” theory
By Paget S.
The distribution of
secondary
growth in cancer of the
breast
Lancet, 1889
Seed: tumor cell with metastatic
potential Soil: microenviroment
转移器官特异性的机制
(1) 肿瘤细胞表型的差异
------异质性
表现
细胞表面糖蛋白复合物、抗原、
酶活性、运动能力等
如 EGFR(-)/EGFR(+)
HEx20
TFCx20
EBERx20
HEx20
EBERx20
NPC65
TFCx20
HEx60
EBERx60
NPC65
TFCx60
（2）组织器官微环境差异
实验证明
不同肿瘤移植于相同器官
同种肿瘤移植于不同器官
侵袭转移能力有差异
如：部位相同
不同部位
小鼠胃癌、人食管癌
皮下、肌肉和腹腔
• 继发器官微环境对肿瘤细胞的特
殊亲和性
① 继发器官脉管内皮细胞
及细胞外基质结构
② 化学趋化因子作用
③ 器官相关的免疫状态
④ 各种生长因子作用
鼻咽癌转移
裸鼠模型
肿瘤发生转移
需要哪些条件？
三、肿瘤细胞发生转移的条件及
转移特点
（一）转移发生的条件
1.细胞变异—转移异质性
瘤细胞遗传不稳定
异质性演进
转移亚克隆优势生长
依据
转移异质性实验依据1977 Fidler
Clone
本实验室进行裸鼠体内筛选高转移癌株：
CNE-2Z-H5
BALB/c nude mice
Nine times
Spontanous
metastasis
Tissue culture
2. 微环境和机体免疫状态
（1）毗邻细胞
旁分泌各种生长因子，
促进肿瘤生长
（2）血液流变学改变
表现 血浆粘稠度及
红细胞密度高
（3）机体的免疫反应
（4）细胞粘附性改变
瘤细胞—瘤细胞间粘附力下降
瘤细胞—细胞外基质(ECM)粘
附力增高
肿瘤转移的条件
四、肿瘤转移过程及其影响因素
Fidler
（一）原发瘤的形成与生长
即正常细胞的转化和生长
（二）肿瘤血管生成
• 始于肿瘤直径达1-2mm
• 与宿主血管网互相联系
• 受血管生成因子和抑制因子
共同调控
（三）肿瘤细胞脱落并侵入基质
1. 瘤细胞 粘附能力改变
同质型粘附力低
异质性粘附力高
易侵袭转移
细胞粘附力与转移关系
细胞系
LA1
LAD
LA5
CNE2L4
CNE2L2
同质粘附% 异质粘附% 转移率%
91.29
88.5
72.5
63
92
0
16
32
13
100
有关影响因素
•
•
•
•
•
瘤细胞间桥粒减少
瘤细胞表面负电荷增加
钙粘蛋白表达水平下降
瘤细胞表面受体改变
瘤细胞表面纤维连接蛋白减少
2. 瘤细胞表面负电荷增加
实验表明：
细胞系
MFC-C-64
MFC-C-38
CNE2L4
CNE2L2
电泳率
0.73μm/sec/v/cm
0.83 μm/sec/v/cm
0.76 μm/sec/v/cm
1.36 μm/sec/v/cm
转移率%
7.5
31.4
13
100
3. 瘤细胞运动能力增强
细胞系
36h
转移率%
(μm/h)
LA1
LAD
LA5
CNE2L4
CNE2L2
198
285
316
16.94
28.94
0
16
32
13
100
参与调控肿瘤细胞运动的因子
促进瘤细胞运动与生长，如
EGF,肝细胞生长因子等
刺激肿瘤细胞运动和侵袭的因子，
如：自分泌运动因子(AMF)
刺激瘤细胞运动而抑制其生长，
如TGF,干扰素等
4. 瘤细胞产生蛋白水解酶增加
主要包括
• 血浆纤维蛋白溶解酶原激活物
（Plasminogen activators,PA)
• 组织蛋白酶(cathepsins)
• 基质金属蛋白酶
(Matrix metalloproteinase,MMPs）
（四）瘤细胞进入脉管系统
• 新生脉管管壁不完整
• 瘤细胞通过运动、粘附、侵袭血
管基底膜而进入脉管
（五）瘤细胞与脉管粘附及瘤栓形成
• 循环中的瘤细胞互相粘连或与血
小板粘附形成瘤栓。
• 瘤细胞通过粘附分子介导与内皮
细胞粘附（选择素、整合素及其
受体等）
• 但瘤细胞与内皮细胞粘附有异质
性
（六）瘤细胞穿出血管
内皮细胞
层损伤
内皮下基
底膜暴露
瘤细胞
粘附
瘤细胞
运动进
入间质
降 解
基底膜
（七）转移灶生长及再侵袭转移
• 瘤细胞与靶器官的实质细胞粘附
• 瘤细胞和靶器官分泌各种生长因
子刺激瘤细胞增殖
• 新生血管形成
微小转移的概念
1971年 Huvos 直径<2ｍｍ
Fisher直径<1.3ｍｍ
1980年 Black直径小于受累淋巴结的
20%作为标准
1993年国际抗癌联盟(UICC)1～2ｍ
ｍ
目前, 直径<2ｍｍ
• 肿瘤可转移至淋巴结(包括新鲜
淋巴结和石蜡切片)、骨髓、外
周血及其他体液等,较多见的取
材为淋巴结、骨髓、外周血。
微小转移检测方法
• 细胞学方法
癌细胞数量很少,鉴别良、恶性细胞仍有困
难,其特异性和敏感性差,阳性率1%
• 连续切片法 工作量繁重,费时费力 7%～
33%
• 免疫学方法
抗上皮细胞膜/骨架成份的单克隆抗体检测
肺癌、乳腺癌、结肠癌等播散至外周组织
中的癌细胞。
微小转移检测方法
• 聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应
PCR、RT-PCR
高效率、高灵敏度、高特异性、操作简
简便,现已能测定组织、体液中的单个
癌细胞
诊断特异性尚存在争议
• 定量ＰＣＲ法
具有更高的特异性和敏感性
微小转移检测方法
• 癌基因直接检测法
肺和6例癌组织均有ＭＵＣ1基因表达,
正常淋巴结无
• 端粒酶活性检测
外周血端粒酶活性,反映血液微转移
的情况,是一种潜在的预后指标。
五、肿瘤侵袭转移的分子机制
(一) 肿瘤转移的基因表达调控
1.癌基因(Oncogenes)
研究表明：多种癌基因与转移相
关，如 Myc, Mos,Raf, Fos,Ras等
• 以Ras为例：
Ras 家属：N-Ras,K-Ras,
H-Ras
实验依据：Collard(1987)
H-Ras gene
H-Ras gene
Transfection
小鼠T淋巴瘤细胞
BW5147(无侵袭转移力）
体外侵袭
体内转移
提示：H-Ras促进BW5147
侵袭转移
以NIH/3T3细胞为对象的研究
还发现：H-Ras 可以改变某些
基因表达水平
活性或表达高
Osteopontin
Calcyclin
组织蛋白酶L
组织蛋白酶B
MMPs
活性或表达低
TIMP
TIMP-2
Jun
Fos
2. 抑癌基因
目前已发现的抑癌基因近20种
如Rb,P53,P15,P16,APC等。
实验证实：
高转移肺癌
细胞系PG
P53wtmRNA
低于正常
PCR-SSCP检测p53,CD44v突变情况
P53突变
CD44v6突变
3. 转移抑制基因— nm23
发现 Steeg(1988)从小鼠黑色素
瘤细胞系中克隆出
基因 定位17q22,533bp
有两个亚型H1,H2
蛋白 17KD, 与核苷酸二磷酸激
酶(NDPK)高度同源
功能
A. 通过与NDPK相似途径参与细 胞
分化、信号转导的调控
B . 影响微管的聚合以调节细胞运动
C. 影响G蛋白的信号转导过程
与转移的关系
A. 在多数肿瘤中，nm23-H1表达水
平与转移潜能呈负相关
B. 在癌转移过程中，出现等位基因
缺失，造成其蛋白功能异常
C. nm23-H2基因常出现点突变，蛋
白结构被破坏
（二）粘附分子与肿瘤转移
1. 粘附的类型
细胞间粘附(同质
或异质）
细胞与ECM粘附
2.粘附分子的种类与作用
（1）整合素(integrins)
•整合素为跨膜糖蛋白
•由α和β两个亚基构成异
二聚体
• 参与不同细胞间及细胞
与细胞外基质粘附
• 受多种活化因子活化
（2）钙粘蛋白(Cadherin)
• 为跨膜糖蛋白家族
E-CD:上皮组织
P-CD:上皮、胎盘
N-CD:神经组织
• 基因定位于16q22-q23.1
• E-CD 和 Catenin 构成复合体
介导同源细胞粘附
• E-CD 的低表达促进多数肿瘤
侵袭转移
(3) 免疫球蛋白类粘附分子
•主要介导细胞与细胞间粘附
• 包括ICAM-1、VCAM-1、
NCAM等
• ICAM-1， VCAM-1过表达，肿
瘤侵袭能力强
• NCAM 低表达，促进转移
(4) 选择素（selectins)
• 包括
L-选择素 存在于白细胞表面
E-选择素 内皮细胞
P-选择素 参与瘤细胞与血小板粘附
• 选择素 参与瘤细胞聚集和瘤细胞
与特定内皮细胞锚定
（5）CD44分子
• 分标准型(CD44s)和变异型
(CD44v)
• 为跨膜蛋白，细胞内部分与细
胞骨架相连，膜外部分与透明质
酸(HA) 等配体作用
• 介导细胞与细胞、细胞与ECM
之间粘附，为淋巴细胞的归巢受
体
• 具有信号转导作用
• 通过影响细胞粘附、运动和胞外
基质降解而参与肿瘤转移
(三) 肿瘤血管生成与转移
1. 血管生成的过程
⑴ 血管内皮基底膜降解
⑵ 内皮细胞向肿瘤组织迁移
⑶ 内皮细胞增殖
⑷ 管腔及血管网形成
⑸ 形成新基底膜
• Fig 4-14
Cancer cells disseminate to remote organs
via blood stream
x
Function of tumor
vessels
• Supply tumors
with oxygen,
nutrients and
growth factors
• Transport of CO2
and toxic
components away
from the tissue
• Mediate tumor
metastasis
2. 肿瘤血管生成的调节
促进因子
抑制因子
纤维母细胞生长因子(bFGF)
干扰素(INF-α,β)
血管内皮细胞生长因子(VEGF) 转化生长因子(TGF)
转化生长因子(TGF- α)
血小板因子4
TNF α
PAI
PA
TIMPs
PDEGF MMPs
IL-8
低氧诱导VEGF mRNA表达 (RT-PCR)
Isoforms
Folds
s
R e la tive le ve l o f m R N A
.7 5
*
N o rm o xia
H yp o xia
.6 0
**
.4 5
.3 0
.1 5
*
0 .0 0
VEGF189
VEGF165
VEGF145
VEGF121
2.67±0.30(P>0.05)
2.05±0.03(P<0.01)
2.73±0.15(P<0.05)
1.65±0.01(P<0.05)
VEG F189 VEG F165 VEG F145 VEG F121
V E G F Iso fo rm s
VEGF in hypoxic cells was
(2.20±0.07)-fold of that in
normoxic cells.
*Independent Samples T-Test:
t=8.944, P<0.05
R e la tive O D V a lu e o f V E G F P ro te in
低氧诱导VEGF 蛋白表达 (Western-Blot)
**
40000
30000
20000
10000
0
N o rm o xia
H yp o xia
G ro u p
（四）蛋白水解酶与肿瘤转移
1. 纤维蛋白溶解酶原激活剂及其
抑制剂(PA and PAI)
(1) PA的分类与功能
• 分组织型(t-PA)和尿激酶型
(u-PA)
• 不同的基因产物，结构相似，即
单链丝氨酸蛋白酶
• 参与肿瘤侵袭转移过程，包括细
胞分化、血管生成、细胞迁移、
基质降解等
M
CNE-2Z CNE-2Z-H5 CNE-2Z-H5-9
l uPAmRNA
246bp
图1
uPA在鼻咽癌细胞中的表达
灰 度 比 值 （ ratio）
2.5
**
2
1.5
1
0.5
**
**
0
CNE-2Z
CNE-2Z-H5 CNE-2Z-H5-9
图 2 各 鼻 咽 癌 细 胞 RT-PCR 结 果 uPA
mRNA与GAPDH mRNA灰度比值
l
uPARm RN A
310bp
图3 uPAR mRNA在鼻咽癌细胞中的表达
灰 度 比 值 (ratio)
4
**
3
2
1
**
**
0
CNE-2Z
CNE-2Z-H5
CNE-2Z-H5-9
图4 各鼻咽癌细胞RT-PCR uPAR mRNA结
果与GAPDH mRNA灰度比值
Western Blot检测 uPAR在CNE-2Z,H5,H5-9中的表达
CNE-2Z
H5
H5-9
60KD
55KD
l
P A I-1 m R N A
1 .2 2 k b
图5 PAI-1 mRNA在鼻咽癌细胞中的表达
(2) PAI的分类与功能
• 包括PAI-1,2,3
• PAI-1为糖蛋白，52KD,
PAI-2分子量46.6KD,
为u-PA抑制剂
• 在多数肿瘤中高表达，提示
预后好
灰 度 比 值 (ratio)
2
1.5
1
0.5
0
CNE-2Z
CNE-2Z-H5
CNE-2Z-H5-9
图 6 各 鼻 咽 癌 细 胞 RT-PCR 结 果 PAI1mRNA与GAPDHmRNA灰度比值
2.基质金属蛋白酶及其抑制剂
( MMPs/TIMPs)
(1) 分类与结构
• 为Zn依赖的内肽酶，包括
胶原酶(collagenase)
明胶酶(gelatinase)
基质溶素(tromitysinase)
膜型MMP(MT-MMPs)
• 能降解ECM中所有成分
• 诱导和促进新生血管形成
• 调节瘤细胞的粘附
细胞外基质（ECM）
胶原蛋白、弹性蛋白、
糖蛋白、蛋白多糖
免疫组化检测鼻咽癌组织中MMP-2,MMP-9,LMP-1
的表达情况
±LMP1
ÇÑÊÑ×
±MMP-2
Ç Ñ Ê °©
×MMP-9
ª ÒÆÔî
p o s itiv e ra te %
100
80
60
40
20
0
LM P1
M M P -2
M M P -9
（五）机体免疫与转移
1. 参与控制转移的免疫细胞
（1）NK细胞
为第一道防线，无需抗原刺激
可杀伤瘤细胞
依据
环磷酰胺
• 小鼠
清除NK细胞
移植肿瘤于小鼠
• 裸小鼠
移植肿瘤于小鼠
转移早
T细胞缺陷，
NK细胞存在
转移率相对低
（2）巨噬细胞
其活性与转移抑制能力呈正相关
实验表明
巨噬细胞抑制剂
促进转移
巨噬细胞激活剂
减少转移
（3）T细胞
Ts细胞 促进肿瘤生长与转移
Th细胞 增强杀伤T细胞的作用
杀伤T细胞 抑制和杀伤瘤细胞
问题与展望：
• 转移各步骤和不同微环境中癌细胞基因表
达谱变化尚难确定
• 各信号转导通路之间形成的交叉对话
(Cross-talking)机制有待阐明
• 肿瘤临床诊断、疗效评价及预后判断的敏
感标记物有待确定。
• 高通量技术平台的建立将为肿瘤转移研究
带来新的希望
一、肿瘤侵袭转移的分子机制
（续）
（二）粘附分子与肿瘤转移
1.粘附的类型
细胞间粘附(同质
或异质）
细胞与ECM粘附
2. 粘附分子的种类与作用
（1）整合素(integrins)
•整合素为跨膜糖蛋白
• 参与不同细胞间及细胞
与细胞外基质粘附
• 受多种活化因子活化
（2）钙粘蛋白(Cadherin)
• 为跨膜糖蛋白家族
E-CD:上皮组织
P-CD:上皮、胎盘
N-CD:神经组织
• 基因定位于16q22-q23.1
• E-CD 和 Catenin 构成复合体
介导同源细胞粘附
• E-CD 的低表达促进多数肿瘤
侵袭转移
(3) 免疫球蛋白类粘附分子
•主要介导细胞与细胞间粘附
• 包括ICAM-1、VCAM-1、
NCAM等。
• ICAM-1， VCAM-1过表达，
肿瘤侵袭能力强。
• NCAM 低表达，促进转移。
(4) 选择素（selectins)
• 包括
L-选择素 存在于白细胞表面。
E-选择素 内皮细胞
P-选择素 参与瘤细胞与血小板粘附
• 选择素 参与瘤细胞聚集和瘤细胞
与特定内皮细胞锚定。
(三) 肿瘤血管生成与转移
1.血管生成的过程
⑴ 血管内皮基底膜降解
⑵ 内皮细胞向肿瘤组织迁移
⑶ 内皮细胞增殖
⑷ 管腔及血管网形成
⑸ 形成新基底膜
• Fig 4-14
Cancer cells disseminate to remote organs
via blood stream
x
Function of tumor
vessels
• Supply tumors
with oxygen,
nutrients and
growth factors
• Transport of CO2
and toxic
components away
from the tissue
• Mediate tumor
metastasis
2.肿瘤血管生成的调节
促进因子
抑制因子
纤维母细胞生长因子(bFGF)
干扰素(INF-α,β)
血管内皮细胞生长因子(VEGF) 转化生长因子(TGF)
转化生长因子(TGF- α)
血小板因子4
TNF α
PAI
PA
TIMPs
PDEGF MMPs
IL-8
低氧诱导VEGF mRNA表达 (RT-PCR)
Isoforms
Folds
s
R e la tive le ve l o f m R N A
.7 5
*
N o rm o xia
H yp o xia
.6 0
**
.4 5
.3 0
.1 5
*
0 .0 0
VEGF189
VEGF165
VEGF145
VEGF121
2.67±0.30(P>0.05)
2.05±0.03(P<0.01)
2.73±0.15(P<0.05)
1.65±0.01(P<0.05)
VEG F189 VEG F165 VEG F145 VEG F121
V E G F Iso fo rm s
VEGF in hypoxic cells was
(2.20±0.07)-fold of that in
normoxic cells.
*Independent Samples T-Test:
t=8.944, P<0.05
R e la tive O D V a lu e o f V E G F P ro te in
低氧诱导VEGF 蛋白表达 (Western-Blot)
**
40000
30000
20000
10000
0
N o rm o xia
H yp o xia
G ro u p
（四）蛋白水解酶与肿瘤转移
1. 纤维蛋白溶解酶原激活剂及其
抑制剂(PA and PAI)
(1) PA的分类与功能
• 分组织型(t-PA)和尿激酶型
(u-PA)
• 为不同的基因产物，结构相似，
单链丝氨酸蛋白酶。
• 参与肿瘤侵袭转移过程，包括细
胞分化、血管生成、细胞迁移、
基质降解等。
M
CNE-2Z CNE-2Z-H5 CNE-2Z-H5-9
l uPAmRNA
246bp
图1
uPA在鼻咽癌细胞中的表达
灰 度 比 值 （ ratio）
2.5
**
2
1.5
1
0.5
**
**
0
CNE-2Z
CNE-2Z-H5 CNE-2Z-H5-9
图 2 各 鼻 咽 癌 细 胞 RT-PCR 结 果 uPA
mRNA与GAPDH mRNA灰度比值
(2) PAI的分类与功能
• 包括PAI-1,2,3
• PAI-1为糖蛋白，52KD,
PAI-2分子量46.6KD,
为u-PA抑制剂
• 在多数肿瘤中高表达，提示
预后好。
l
P A I-1 m R N A
1 .2 2 k b
图5 PAI-1 mRNA在鼻咽癌细胞中的表达
灰 度 比 值 (ratio)
2
1.5
1
0.5
0
CNE-2Z
CNE-2Z-H5
CNE-2Z-H5-9
图6 各鼻咽癌细胞RT-PCR结果PAI-1 mRNA与
GAPDHmRNA灰度比值
2. 基质金属蛋白酶及其抑制剂
( MMPs/TIMPs)
(1) 分类与结构
• 为Zn依赖的内肽酶，包括
胶原酶(collagenase)
明胶酶(gelatinase)
基质溶素(tromitysinase)
膜型MMP(MT-MMPs)
• 能降解ECM中所有成份。
• 诱导和促进新生血管形成。
• 调节瘤细胞的粘附。
免疫组化检测鼻咽癌组织中MMP-2,MMP-9,LMP-1
的表达情况
±慢性鼻咽炎
ÇÑÊÑ×
±鼻咽癌
Ç Ñ Ê °©
×淋巴结转移癌
ª ÒÆÔî
p o s itiv e ra te %
100
80
60
40
20
0
LM P1
M M P -2
M M P -9
MMP-2
MMP-9
（五） 机体免疫与转移
1、参与控制转移的免疫细胞
（1） NK细胞
为第一道防线，无需抗原刺激
可杀伤瘤细胞。
实验依据：
环磷酰胺
l小鼠
移植肿瘤于小鼠
清除NK细胞
转移早
l先天无NK Bejge 小鼠转移早
l裸小鼠
移植肿瘤于小鼠
T细胞缺陷，
NK细胞存在
转移率正常
（2）巨噬细胞
其活性与转移抑制能力呈正相关
实验表明：
巨噬细胞抑制剂
促进转移
巨噬细胞激活剂
减少转移
（3）T细胞
Ts细胞 促进肿瘤生长与转移
Th细胞 增强杀伤T细胞的作用
杀伤T细胞 抑制和杀伤瘤细胞
问题与展望：
• 转移各步骤和不同微环境中癌细胞基因表
达谱变化尚难确定。
• 肿瘤临床诊断、疗效评价及预后判断的敏
感标记物有待确定。
• 高通量技术平台的建立将为肿瘤转移研究
带来新的希望。
二、抗转移治疗的新策略
• 策略
– 针对肿瘤细胞（严打：应用各种
细胞毒药物）
– 针对瘤细胞生存微环境（整治环
境）
抗转移治疗的新方法
1.抑制肿瘤血管生成
即针对肿瘤血管形成的某些
因子及其关键步骤进行干预
⑴ 抑制血管内皮细胞活化类
药物，如RhuMAb VEGF，
FLK-1(DC101)
(2) 抑制血管内皮细胞的分裂与
迁移,如Angiostatin(血管抑素），
endostatin（内皮抑素），
TNP-470
(3)抑制基底膜或细胞外基质降解类药
物
(4)封闭整合素功能类药物
2. 细胞粘附分子抑制剂与抗转移
（1）阻止粘附信号的传递
蛋白酪氨酸激酶(PTK)
抑制剂（Genistein)
（2）抑制Integrins 依赖性的粘附
如 环孢霉素等
（3）增强E-cadherin介导的同质
粘附
3.蛋白酶抑制剂的应用
（1）MMPs抑制剂
a. Batimastat
为人工合成的小分子MMP
抑制剂，能与MMP活性基
团结合，能抑制MMP-2,9等
b. Marimastas
为第二代人工合成MMP抑制剂，
副作用小，病人耐受好等，能抑
制多种MMP活性
（2）uPA 抑制剂如抗uPA抗体
及多肽
4.基因治疗
1. 定义
基因治疗 将正常的外源基因
导入生物体或人体靶细胞内
以弥补所缺失的基因、或关
闭、降低异常表达的基因，
以达到治疗疾病的目的。
2.肿瘤转移基因治疗的策略
⑴ 增强宿主抗癌免疫
⑵ 恢复或增强抑癌基因的功能
⑶ 阻断癌基因
⑷ 增强化疗和放疗敏感性
⑸ 细胞基因杀伤效应
3.基因治疗的途径
1. ex vivo 途径: 将人体细胞从体内取出, 基
因改造, 再移植到人体中. 自体,同种异体,
异种细胞, 同种异体或异种组织和器官等.
2. in vivo 途径: 直接将基因转移到人体中,
如DNA注射,口服, 喷雾等. 有如普通治疗
药物, 商业化发展方向所在.
基因治疗的ex vivo 途径
基因治疗的in vivo 途径
基因治疗就与打针和吃药一样.
举例
nm23 gene
转染
高转移癌细胞
TIMP gene
转移能力降低
三、肿瘤侵袭转移研究的基本
策略与技术
（一）研究策略
• 整体水平：人癌动物模型
–
–
–
–
自发性癌症动物模型
诱发性癌症动物模型
可移植性癌症动物模型（裸鼠，SCID小鼠）
转基因癌症动物模型
• 细胞水平（细胞培养、杂交瘤技术等）
• 裸小鼠特征：
– 外观无毛，裸体，皮肤薄，发育迟缓。
– 无胸腺
– T细胞功能欠缺
– 无细胞毒效应，无移植排斥
– 成年鼠NK细胞活性增加
– 抵抗力低
– 11号染色体突变
• SCID小鼠特征
(Severe Combined Immune Deficency)
– 外观正常
– 16号染色体突变，T、B缺陷
– 免疫学特征为T 、B细胞明显减少
• 细胞水平（细胞培养技术等）
• 组织水平研究
• 分子水平研究
– 染色体水平
– DNA水平
– RNA水平
– 蛋白水平
（二）高通量技术在肿瘤研究中
的应用
1.常用分子生物学技术的应用
– 重组DNA技术
– PCR,RT-PCR,PCR-SSCP
– Southern blot,Northern blot
– Western blot
2. 高通量技术的应用
• 染色体、DNA水平(Genomics):比较
基因组杂交(CGH)
• RNA水平(Transcriptomics):差异显
示(DD-PCR),抑制消减杂交(SSH)，
基因表达系列分析(SAGE), 基因芯
片(cDNA array).
• 蛋白质水平(Proteomics):2-D gels
比较基因组杂交(Comparative
Genomic Hybridization,CGH)
• CGH 原理：将两种不同荧光标
记的基因组DNA等比例与正常分
裂中期染色体竞争杂交，分析每
条染色体上荧光强度比率，推测
待检DNA拷贝数变化。
• 基本方法：
– 正常中期染色体制备
– 基因组DNA分离
– DNA标记
– 杂交和染色
– 荧光镜检和图象分析
Tissue Microdissection
equipments
Tissue Microdissection
Analysis of single cell by immunohistochemical stain (p53)
I. Ethanol fixation/paraffin embedding
II. p53 Immunohistochemical staining
Breast
Colon
III. Microdissection of stained single cells
IV. Stimulated PCR from single cells
V. Sequence analysis to detect mutations
Laser Capture Microdissection
(LCM)
• 应用：
– 确定肿瘤染色体区DNA扩增与丢失
– 对肿瘤进行分期与分级
– 诊断与鉴别诊断
– 预后与治疗反应
RNA水平(Transcriptomics)研究
• 差异显示(Differential display PCR,
DD-PCR)
• 原理：
– 基因差异表达
– 用oligo-dT引导逆转录，再用随机引物
和逆转录（锚定引物）扩增cDNA片段，
PAGE胶分离，比较胶上差异条带识别
差异表达基因。
操作步骤
•
•
•
•
•
样品RNA分离
反转录成cDAN
PCR扩增
电泳
结果分析
DD-PCR
抑制削减杂交(SSH)
样品2
样品1
SSH
基因芯片
• 原理与操作步骤
– 在固相支持物上合成/印迹探针阵列
– 样品（DNA/mRNA）标记
– 样品与芯片杂交
– 激光扫描、计算机分析表达谱
蛋白质组技术（Proteomics)
表达蛋白质组学和功能蛋白质组学
•
•
•
•
蛋白质双向电泳（2-D gel)
图像采集与计算机分析
质谱技术
蛋白质芯片技术
2-D gels
Protein arrays
Summary:
Tissue/cells
Tissue arrays
Cell arrays
Tumor samples
Genomics
transcriptomics
Delection
Gene profiles
Amplification (cDNA microarray
Methylation
,SAGE)
Mutation
(CGH array)
Molecular classification
Biomarkers
Target therapy
proteomics
Protein profiles
(2-D gel
Mass spectrometry
protein microarray
Nature is beautiful
Research is fascinating
主要参考文献
1. 曾益新主编， 肿瘤学， 人民卫生出
版社：1999，第一版
2. 汤钊猷主编，现代肿瘤学，上海医
科大学出版社, 2001，第二版
3. 陈意生等主编, 肿瘤分子细胞生物
学,人民军医出版社：2002，第一版
3、高进主编，癌的侵袭与转移—
基础研究与临床，北京医科大学
中国协和医科大学出版社，
1996，第一版
4、鄂 征主编， 癌变机理研究，
北京出版社，1999，第一版
5、近期有关肿瘤研究新文献
Cancer ,Cancer Research
Nature, Science
国外医学.肿瘤学分册
. 分子生物学分册
. 生理病理科学与临床分册
癌症,中华肿瘤杂志等等。