Transcript Centrifugēšana

Centrifugēšana
Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā
MSc. biol. Aija Ozola
[email protected]
Kas ir centrifugēšana?
• Metode, ko izmanto, lai atdalītu pēc izmēra/
formas/blīvuma atšķirīgas vielas daļiņas, kas
suspendētas šķidrumā
centrifugēšana
Kas ir centrifugēšana?
• Centrifugēšanu izmanto, lai nogulsnētu,
atdalītu, izolētu:
– Šūnas, baktērijas, vīrusus
– Šūnu organellas
– Makromolekulas (proteīnus, nukleīnskābes)
• Centrifugēšanu lieto, kad materiālu nevar
filtrēt, piemēram, ja tas satur daudz blīvu
sastāvdaļu (šūnu, šūnu atlieku)
Centrifugēšanas fizikālie principi
• Sedimentācija daļiņas nosēšanās ārēja spēka ietekmē
• Kādi ārējie spēki ietekmē daļiņu?
– Zemes gravitācijas spēka lauks
– Centrifugālā spēka lauks
Stoksa likums
• Apraksta sfēriskas daļiņas gravitāciju,
kur uz daļiņu iedarbojas 3 spēki:
– Fg - gravitācijas spēks
– Fb - peldspēja
– Fd - šķidruma viskozitātes radīts spēks
• Daļiņa sedimentēsies ar konstantu
ātrumu, kad Fg = Fb + Fd
Stoksa likums
d
d
šķ
g
d
η
v
sfēriskās daļiņas diametrs
daļiņas blīvums
šķīduma blīvums
daļiņai pieliktais paātrinājums
(980 cm/s2)
sfēriskās daļiņas diametrs
šķīduma viskozitāte
sedimentācijas ātrums
• Ātrums, ar kādu daļiņa sedimentēsies būs:
Stoksa likums
• Secinājumi:
– Sedimentācija ir proporcionāla:
• daļiņas lielumam
• daļiņas un šķīdumu blīvuma starpībai
– Sedimentācija nenotiek, kad daļiņas blīvums ir
vienāds ar šķīduma blīvumu
– Sedimentācijas ātrums samazinās, palielinoties
šķīduma viskozitātei
– Sedimentācijas ātrums palielinās, palielinoties g
Centrifugēšana
• Daļiņas sedimentācija centrifugālā spēka laukā
ω
Fc
ω
r
centrifugālā spēka lauks
rotācijas ātrums
attālums no rotācijas ass
r
Stoksa likums centrifugēšanā
• Sedimentācijas ātrums:
– gravitācijas ietekmē
– centrifūgā
Relatīvais centrifugālais spēks (RCF)
• Praksē pielieto:
RCF
ω
r
g
relatīvais centrifugālais spēks
rotācijas ātrums
attālums no rotācijas ass
gravitācijas paātrinājums 980 m/s2
• Rāda, cik reizes lielāks spēks centrifūgas rotorā
iedarbojas uz daļiņu, salīdzinot ar gravitācijas spēku
(piemēram, 4000 x g)
Rotora griešanās ātrums
• Praksē rotora griešanās ātrumu mēra
apgriezienos minūtē
– revolutions per minute (rpm)
rotācijas ātrums
ω
rpm apgriezieni minūtē
RCF un rpm sakarība
• Ja
• un
• tad
RCF
ω
r
rpm
relatīvais centrifugālais spēks
rotācijas ātrums
attālums no rotācijas ass
apgriezieni minūtē
RCF ↔ rpm: nomogrammas
Zinot centrifūgas rotora
rādiusu, RCF (g) iespējams
pārvērst par rpm un
otrādi
http://aquaticpath.umd.edu/nomogram.html
RCF ↔ rpm: online kalkulatori
http://insilico.ehu.es/mini_tools/rcf_rpm.php
Sedimentācijas koeficients
• Raksturo daļiņas sedimentāciju centrifugējot
S
v
ω
r
d
• Atkarīgs no daļiņas:
– lieluma
– blīvuma
– formas (kompaktuma)
d
šķ
η
sedimentācijas koeficients
sedimentācijas ātrums
rotācijas ātrums
attālums no rotācijas ass
daļiņas diametrs
daļiņas blīvums
šķīduma blīvums
Šķīduma viskozitāte
Sedimentācijas konstante
• Lai sedimentācijas koeficents būtu konstante,
sedimentācijas koeficentu nosaka ūdenī 20°C
• Bioloģiskām makromolekulām
Svedbergs (S)
• Sedimentācijas konstantes mērvienība
• Raksturo, ar kādu ātrumu daļiņa nogulsnēsies
ultracentrifūgā
• Theodor H. E. Svedberg (1884 – 1971)
•
1926 (ķīmijā)
Sedimentācijas konstantes bioloģijā
Eikariotu šūnas
Šūnu kodoli
Lizosomas
Ribosomas (eikariotu)
Ribosomas (prokariotu)
Nukleīnskābes
Proteīni
100 000S
50 000S
9400S
80S (60S + 40S)
70S (50S +30S)
4-100S
2-20S
Sedimentācijas konstantes bioloģijā
Eikariotu šūnas
Šūnu kodoli
Lizosomas
Ribosomas (eikariotu)
Ribosomas (prokariotu)
Nukleīnskābes
Proteīni
100 000S
50 000S
9400S
80S (60S + 40S)
70S (50S +30S)
4-100S
2-20S
Sedimentācijas konstantes bioloģijā
Koolman & Rohm. 2004. Color Atlas of Biochemistry.
Peldošais blīvums
DNS peldošais blīvums
Aprēķināts pēc ķīmiskā sastāva
Koncentrētā CsCl
g/cm3
2
1,7
Ūdenī
1,1
Šūnu organellu peldošie blīvumi saharozes gradientā:
Goldži komplekss
1,06 – 1,10
Plazmas membrāna
1,16
Mitohondriji
Lizosomas
1,19
1,21
Ribosomas
Šķīstošie proteīni
1,40
1,30
Centrifugēšanas veidi
1. Diferenciālā centrifugēšana
2. Centrifugēšana blīvuma gradientā
a) Zonālā
b) Izopikniskā
1. Diferenciālā centrifugēšana
• Metode, ar kuru vienkārši nogulsnēt šūnas un
to sastāvdaļas, kas izdalītas no homogenāta
• Pēc lieluma, blīvuma un/vai formas atšķirīgas
daļiņas sedimentējas ar dažādu ātrumu
• Problēmas:
– kontaminācija (starp lielākām daļiņām atrodamas
arī mazākas)
– grūti atšķirt daļiņas ar līdzīgām īpašībām
Homogenizēšana
• Process, kurā noārda
audus, šūnu
membrānas un atbrīvo
šūnas saturu, iegūstot
homogenātu
• Empīriska metode
homogenizators
Homogenizēšanas metodes
• Fizikālas (lieto visbiežāk):
–
–
–
–
–
–
Berzes spēks
Hidrodinamisko spēks
Prese
Ultraskaņa
Sasaldēšana /atkausēšana
Osmotiskais šoks
• Ķīmiskās:
– apstrāde ar enzīmiem
homogenizators
1. Diferenciālā centrifugēšana
2. Centrifugēšana blīvuma gradientā
a) Zonālā
b) Izopikniskā
• Gradients tiek pagatavots
pirms centrifugēšanas
• Gradients veidojas
centrifugēšanas procesā
• Gradienta koncentrācija ir
neliela, rpm mazāk
• Gradienta koncentrācija ir
augsta, rpm vairāk
• Paraugs tiek uznests gradienta • Paraugs tiek sajaukts ar
augšpusē
centrifugēšanas vidi
• Balstās uz daļiņu lielumu un
masu
• Balstās uz daļiņu blīvumu
2. Centrifugēšana blīvuma gradientā
a) Zonālā
b) Izopikniskā
• Gradientam jābūt pietiekami • Gradienta garumam nav tik
garam, lai daļiņas atdalītos
liela nozīme
• Svarīgi nepārsniegt
centrifugēšanas ilgumu
• Centrifugēšanas laikam jābūt
pietiekami garam, lai daļiņas
nonāktu līdz to izopikniskajam
punktam. Ilgāks
centrifugēšanas laiks rezultātu
neietekmē
2. Centrifugēšana blīvuma gradientā
a) Zonālā
Koolman & Rohm. 2004. Color Atlas of Biochemistry.
b) Izopikniskā
Vides centrifugēšanai blīvuma gradientā
Šūnas
Vīrusi
Šūnas
organellas
Nukleoproteīni
Makromolekulas
Cukuri
(saharoze)
+
+++
+++
+
-
Polisaharīdi
(fikols)
++
++
++
-
-
+++
+
+++
-
-
++++
++
++++
+++
+
-
++
-
++
++++
Gradients
Koloidālais silīcija
oksīds (perkols)
Jodizētās vides
(nikodenzs)
Sārmu metālu sāļi
(CsCl)
++++ ļoti labs, +++ labs, ++ labs atsevišķos gadījumos,
+ ierobežota lietošana, - nepielieto
Centrifūgu tipi
Laboratorijas
Ātrgaitas
Ultra-
Maksimālais ātrums (rpm)
10 x 103
28 x 103
100/500 x 103
Maksimālais RCF
7 x 103
100 x 103
800/900 x 103
Baktērijas
Jā
Jā
(Jā)
Dzīvnieku un augu šūnas
Jā
Jā
(Jā)
Kodoli
Jā
Jā
(Jā)
Nogulsnēšana
Dažreiz
Galvenokārt
(Jā)
Membrānas
Dažreiz
Dažreiz
Jā
Ribosomas/polisomas
-
-
Jā
Makromolekulas
-
-
Jā
Vīrusi
-
Galvenokārt
Jā
Izmantošana izolēšanā
( ) – var izmantot, bet parasti nelieto
Ultracentrifūgas uzbūve
Rotoru tipi
Leņķa
Vertikālie
Horizontālie
Gallagher SR, Centrifugation, DOI: 10.1002/9780470089941.et0501s00
Rotoru pielietojums
Centrifugēšanas veidi
Rotora tips
Leņķa
Horizontālais
Vertikālais
Diferenciālā
Teicams
Zonālā
Izopikniskā
Ierobežota
Labs makromolekulām,
izmantošana slikts šūnām un šūnas organelām
Labs
Labs
Labs šūnām un šūnas organelām,
jāuzmanās lietojot CsCl gradientu
Neder
Labs
Teicams
Centrifūgas BMC
• Beckman Coulter
ultracentrifūga
Optima L-100 XP
• 100 000 rpm
• Izmaksas ≈ 80 000 Ls
(114 000 €)
– centrifūga ≈ 40 000 Ls
– 4 rotori ≈ 40 000 Ls
Noteikumi strādājot ar centrifūgu
• Vienmēr jāsagaida, kad centrifūga sasniegusi
maksimālo ātrumu un jāpārliecinās, ka tā
normāli darbojas (nav aizdomīgu trokšņu vai
vibrāciju)
• Strādājot ar lieliem apgriezieniem
– jāpārliecinās, ka izvēlēts pareizais rotors
– jāizvēlas pareizie stobriņi
• Centrifugēšanas stobriņiem jābūt līdzsvarā un
tie jāizvieto simetriski!!!
Kā stobriņus pareizi izvietot?
http://onfocuslaboratories.com/support/content/balancing-your-centrifuge
Kā stobriņus pareizi izvietot?
Eppendrof manual
Kā stobriņus pareizi izvietot?
Eppendrof manual
Praktiskais darbs
• Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā
1. Mononukleāro šūnu (limofocītu) izdalīšana no
asinīm. NB!!! Ar asinīm strādāt cimdos!
2. Kodolu frakcijas iegūšana no audu šūnu kultūras
2.1. Šūnu iegūšana no audu šūnu kultūras suspensijas
2.2. Kodolu frakcijas iegūšana
Limfocītu izdalīšana fikola gradientā
PIRMS
PĒC
B - asinis
F - fikols
P - asins plazma, trombocīti
W - limfocīti
R - eritrocīti, granulocīti
http://hipc.stanford.edu/sops/pbmc-isolation-accuspin-conical-method