Transcript 遺伝子工学
遺伝子工学 遺伝子操作の手法 配列特異的DNA鎖切断 制限酵素 DNA鎖連結 DNAリガーゼ 3'末端への塩基付加 ターミナルデオキシリボヌクレオチジル トランスフェラーゼ（TdT） DNA鎖複製 Taqポリメラーゼ（Thermus aquaticus） 逆転写 AMV (Avian Myeloblastosis Virus)-RT MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus)-RT 制限酵素 二本鎖DNAの特定の塩基配列を認識して切断する酵素 EcoRI ＧＡＡＴＴＣ ＣＴＴＡＡＧ Escherichia coli由来 BamHI ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＴＡＧＧ Bacillus amyloliquefaciens由来 HindIII ＡＡＧＣＴＴ ＴＴＣＧＡＡ Haemophilus influenzae由来 付着末端（cohesive end）が残る XbaI ＴＣＴＡＧＡ ＡＧＡＴＣＴ Xanthomonas badrii由来 KpnI ＧＧＴＡＣＣ ＣＣＡＴＧＧ Klebsiella pneumoniae由来 HhaI ＧＣＧＣ ＣＧＣＧ Haemophilus haemolyticus由来 NotI ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＣＧＣＣＧＧＣＧ Nocardia otitidis-caviarum由来 付着末端（cohesive end）が残る DraI ＴＴＴＡＡＡ ＡＡＡＴＴＴ Deinococcus radiophilus由来 SmaI ＣＣＣＧＧＧ ＧＧＧＣＣＣ Serratia marcescens由来 HincII ＧＴＣＧＡＣ ＣＡＧＣＴＧ Haemophilus influenzae由来 ＧＴＴＡＡＣ ＣＡＡＴＴＧ 平滑末端（blunt end）が残る DNA分子の結合１ ＡＡＴＴ ＴＴＡＡ ＡＡＴＴ ＴＴＡＡ DNAリガーゼによる結合 DNAリガーゼによる結合 DNA分子の結合２ dGTP ターミナルデオキシリボヌクレオチジル トランスフェラーゼ（TdT）による付加 ＧＧＧＧ ＣＣＣＣ ＧＧＧＧ ＣＣＣＣ DNAリガーゼによる結合 dCTP 宿主ｰベクター系 ベクター・・・目的遺伝子の運び手 ・宿主細胞内で安定に複製する ・適当な制限酵素切断点を有する ・薬剤耐性などのマーカーを有する シャトルベクター・・・細菌と真核生物双方で増殖できる 大腸菌 プラスミド（pUC系） λファージ コスミド 酵母 シャトルベクター（pUC−酵母ars1） 酵母人工染色体（YAC） 動物細胞 シャトルベクター（pUC−SV40） レトロウイルス（MMLV由来） 昆虫細胞 バキュロウイルス 大腸菌系ベクタープラスミド pBR322 (4,361 bp) pUC18 (2,686 bp) ブルーセレクション X-gal Br OH OH Br HO Cl Cl O HO O OH N H NH 非酵素的 二量体化 β－ガラクトシダーゼ O H N Cl N H Cl Br Br O 青色色素 遺伝子クローニング クローニング・・・ある生物から特定のDNAを取り出して増幅すること 制限酵素による切断 → ベクターDNAに結合 → 宿主細胞内で増幅 → 目的DNAを有する組換え体を選別 クローン・・・目的の遺伝子を含む組換え体 DNA供与体・・・クローニングのためDNAを取り出される生物 ファージベクターを利用したクローニング ファージDNAに目的DNAを挿入 → パッケージング パッケージング・・・組換えDNAをファージ粒子に挿入すること 遺伝子ライブラリー（ジーンバンク） 制限酵素などで断片化された全ゲノムDNAを含むクローン クローニングできる遺伝子のサイズ プラスミド（pUC系） λファージベクター コスミド 酵母人工染色体 ～10 kb ～20 kb ～40 kb ～400 kb 塩基配列決定法 ジデオキシ法（サンガー法） 特定塩基のジデオキシリボヌクレオチドを取り込むとDNA合成が終結 ↓ 電気泳動でオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）を測定 ↓ 特定塩基までの塩基数から特定塩基の位置を決定 ATGCATGCATGCという配列のオリゴヌクレオチド ddCTPを加えてDNA合成反応を行う ↓ ATGCATGCATGC 塩基数12 ATGCATGC 塩基数8 ATGC 塩基数4 ↓ Cは4，8，12番目にある ハイブリッド形成による遺伝子解析 ハイブリダイゼーション（交雑） 相補的な配列をもつ異種DNA同士で二本鎖を形成させること 目的配列を有するDNAを蛍光あるいは放射標識しておけば， 目的の遺伝子を含む ・プラスミドを保有するコロニー（コロニーハイブリダイゼーション） ・ファージにより形成されたプラーク（プラークハイブリダイゼーション） ・アガロースゲル上の切断DNA（サザンハイブリダイゼーション） ・アガロースゲル上のmRNA（ノーザンハイブリダイゼーション） を検出することができる ウエスタンブロット ポリアクリルアミドゲル上のタンパク質 ← 標識抗体 コロニーハイブリダイゼーション ライブラリー遺伝子を含む菌 のコロニー プラークハイブリダイゼーション ライブラリー遺伝子を含む ファージのプラーク ニトロセルロース膜にレプリカ NaOHで変性（一本鎖DNA） 減圧加熱（DNA固定） 目的配列を持つ32P標識DNAと反応 標識されたコロニー（プラーク）から遺伝子を回収 遺伝子変異（改変）と機能解析 人為的に目的の遺伝子を変異させ，その遺伝子機能を解析する 部位指定変異導入 遺伝子内部の目的とする位置に正確に変異を導入し，改変遺伝子を作製する 変異部分を含む遺伝子配列を作製 → 相同組換え トランスジェニック（遺伝子導入）生物 人為的に遺伝子を導入，置換，欠失させて作製した生物 （遺伝子）ノックアウト・・・正常遺伝子を欠失または不活性化させること RNAi（RNA干渉）・・・特定にmRNAの働きを抑制 → 遺伝子機能解析 mRNAの相補鎖（アンチセンス）の導入 特定のmRNAを分解するリボザイム（酵素活性をもつRNA）の導入 siRNA・・・21～23塩基対の2本鎖RNA → 配列特異的にmRNAを切断 DNAマイクロアレイ DNAマイクロアレイ（DNAチップ） mRNAから作製したcDNAを蛍光ラベル ↓ 基板に固定した1本鎖DNAとハイブリダイゼーション ↓ 数千～数十万の遺伝子発現レベルを解析 遺伝子情報と利用 病原細菌の検出と同定 PCR（ポリメラーゼ連鎖反応） 鋳型DNAに対して，特定配列の1本鎖DNAと部分的2本鎖を形成させ， 相補的DNAを合成させる。相補的DNAは鋳型になりうるので， この反応を繰り返すことにより，目的遺伝子を増幅することができる。 鋳型DNA プライマー・・・合成した短鎖DNA 耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA合成速度が速い） 病原細菌や毒素に特異的なDNAをPCR法により検出することができる PCR (Polymerase Chain Reaction) サイクル１ DNA鎖の分離 プライマーの結合 DNA複製 サイクル２ cDNAの調製（RT-PCR） mRNA ＡＡＡＡＡＡ プライマーの結合 ＡＡＡＡＡＡ ＴＴＴＴＴＴ DNAへの逆転写 ＡＡＡＡＡＡ ＴＴＴＴＴＴ アルカリ処理（mRNAを分解） ＴＴＴＴＴＴ 混成２本鎖 １本鎖 cDNAの3'末端は ヘアピンループを形成 DNA複製 ＡＡＡＡＡＡ ＴＴＴＴＴＴ S1ヌクレアーゼ処理 ＡＡＡＡＡＡ ＴＴＴＴＴＴ (PCR) ２本鎖 cDNA 遺伝子解析法 リアルタイムPCR 蛍光色素が結合した短鎖DNAをプローブ（探査針）として用いたPCR プローブまで相補鎖合成が進むと蛍光を発する → 定量可能 RAPD（Randomly Amplified Polymorphic PCR） ランダムに合成した10塩基程度のプライマーを用いたPCR 種の比較などに利用する AP-PCR（Arbitrarily Primed PCR） 反応初期の数サイクルの2本鎖形成条件を緩くし， 1つのプライマーを用いて染色体中の複数の領域を同時に増幅させるPCR バンドのパターンから遺伝的多型性などを評価できる パルスフィールドゲル電気泳動法 数百kb～数Mbの高分子DNAを分離できる バイオテクノロジーの発展 ポリペプチドは遺伝子工学により作ることができる → バイオ医薬品 バイオ医薬品 遺伝子組換え技術あるいは細胞培養技術を用いて製造された ポリペプチドまたはタンパク質を有効成分とする医薬品 微生物分野におけるバイオ医薬品 遺伝子組換えワクチン・・・B型肝炎，ヒトパピローマウイルス 抗体・・・抗RSウイルス抗体 遺伝子組換え作物 害虫抵抗性遺伝子・・・BTトキシン 除草剤耐性遺伝子 遺伝子工学によって生産される医薬の売上げ（2008年度，億円） エポエチン ベータ エポエチン アルファ インフリキシマブ エタネルセプト トラスツズマブ リツキシマブ ベバシズマブ インスリン レノグラスチム 腎性貧血治療薬 腎性貧血治療薬 抗リウマチ薬 抗リウマチ薬 抗がん剤 抗がん剤 抗がん剤 糖尿病治療薬 好中球減少症治療薬 増殖因子 増殖因子 抗体 サイトカイン受容体 抗体 抗体 抗体 ペプチドホルモン 増殖因子 450 440 370 260 240 210 200 150 120 バイオ医薬品の国内市場規模 （富士経済，2009年以降は予測） 億円 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 2007 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 年 代表的なバイオ医薬 医薬 ペプチドホルモン インスリン 成長ホルモン 心房性ナトリウム利尿ペプチド グルカゴン サイトカイン インターフェロンα インターフェロンγ インターロイキン２ 増殖因子 エポエチン（エリスロポエチン） G-CSF 適用 製造法 糖尿病 小人症 急性心不全 低血糖症 大腸菌 大腸菌 大腸菌 酵母 C型肝炎，がん がん がん 大腸菌 大腸菌 大腸菌 貧血 白血球減少 動物細胞 大腸菌 代表的なバイオ医薬 医薬 酵素 t-PA エプタコグアルファ（血液凝固第VII因子） オクトコグアルファ（血液凝固第VIII因子） 受容体 エタネルセプト（TNF-α受容体） ワクチン Ｂ型肝炎ワクチン 抗体 トラスツズマブ（ハーセプチン：抗HER2抗体） リツキシマブ（リツキサン：抗CD20抗体） バシリキシマブ（抗CD25抗体） インフリキシマブ（抗TNF-α抗体） パリビズマブ（抗RSウイルス抗体） 適用 製造法 血栓溶解 血友病 血友病 動物細胞 動物細胞 動物細胞 関節リウマチ 動物細胞 Ｂ型肝炎 酵母 乳がん 悪性リンパ腫 腎移植 関節リウマチ RSV気道感染症 動物細胞 動物細胞 動物細胞 動物細胞 動物細胞 遺伝子組換えと生物多様性 組換え生物 病原遺伝子，毒素遺伝子などの危険な遺伝子が拡散する可能性 在来生物が駆逐され，生物多様性が損なわれる可能性 物理的封じ込め 実験施設の設備，装置による封じ込め P1～P3 生物学的封じ込め 実験に用いる生物の環境における生存能力に関する規制 B1 Escherichia coli K12など B2 Escherichia coli χ1776など（遺伝的欠陥により特殊培養条件必要） カルタヘナ議定書 生物多様性に影響する可能性のある組換え生物の取り扱い法を制限