Transcript １－(２)

形質転換・組み換えDNA
によるタンパク産生
担当教員；花田 耕介
担当技術職員；修行 美恵
1日目
培地の作製を行ってください。
１－(1)培地の作製
１）200mlの三角フラスコ１個にポリペプトン：1g,粉末酵母エキス：0.5g,NaCl：0.5g,寒天末：
1.5gを計り、蒸留水を100ml入れる
２）アルミホイルで蓋（マジックで班名）をする。
３）オートクレーブ（何度、何分かをレポートにも記入）を使用して、滅菌すると同時に寒天を
溶かす。
終わったら、説明します
本実習の意義
•
組み換え生物を作る実習
組換えDNA技術を用い、遺伝子を組み込ませ、過剰にタンパク質を発現させ、生物
種の形質を変える。
•
新たな形質を付加した組換え生物強い規制
・抗病原性遺伝子を過剰に発現(下）
農水省
・四肢、耳、尾で蛍光遺伝子を発現
山梨大学・発生工学センター
•
植物に関しては、比較的緩い。米国等で遺伝子組み換え作物を食べている。日本で
も、外部に遺伝子が流出しないようであれば用いることができる。
•
口に入れない物質を生物に作らせても構わない合成生物学が現在盛んになって
きた。
私の研究室では、
Newtonで紹介
本実習では
大腸菌
ラクトースを分解
する遺伝子(LacZ)
ゲノム
遺伝子配列を増幅する(PCR)
プラスミドに組み込む 1-(2)
プラスミドを大腸菌に挿入（形質転換）
1-(3)
大腸菌
ゲノム
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
プラスミドは多コピーあるのでLac遺伝子がコードするタンパクを大量生産する
観察2-(1)、2-(2)、2-(3)
実際のスケジュール
1 日目
１．形質転換体の作製
１－(1) 培地の作製
１－(2) 遺伝子の導入
１－(3) プラスミドの導入
１－(4) コロニー数のカウント
２．形質転換体でのタンパク質の過剰発現
２－(1) 大腸菌の可溶化
２－(2) SDS-PAGE の泳動
２－(3) 画像解析
２日目
1-(2)遺伝子導入
大腸菌
ラクトースを分解
する遺伝子(LacZ)
ゲノム
遺伝子配列を増幅する(PCR)
プラスミドに組み込む 1-(2)
プラスミドを大腸菌に挿入（形質転換）
1-(3)
大腸菌
ゲノム
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
プラスミドは多コピーあるのでLac遺伝子がコードするタンパクを大量生産する
観察2-(1)、2-(2)、2-(3)
１．形質転換体の作製
1-(2)遺伝子導入
• LacZ遺伝子(約3000bp)
>lacZ
ATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTG…………………………
…………………………………………………………………GCTACCATTACCAGTTG
GTCTGGTGTCAAAAATAA
•
遺伝子DNAは二本鎖でゲノムに存在
GTAATCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTG………GCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAACTTG
CATTAGATACTGGTACTAATGCCTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTTGCAGCAC………CGTAGGTAATGGTCAACCAGACCACAGTTTTTATTGAAC
プライマーのデザイン
• PCRとは
95度で二本鎖は
一本鎖へ
プライマーの構築
72度でDNAは伸長
５‘
Forwadプライマー
５‘
3‘
3‘
3‘
3‘
５‘
Reverseプライマー
５‘
3‘
５‘
3‘
５‘
1-(2)遺伝子導入
導入
プラスミド
導入の仕方は単純でない
• 遺伝子を導入するためには、プラスミドを切断する（制限酵素を利用）
用いる制限酵素
NheＩ
NheＩ
HindIII
G
CGATC
HindIII
AGCTT
A
拡大
実際に制限酵素で
切断すると
CTAGC
G
LacZ遺伝子 ATTCGA
Lac遺伝子の両端に切断カ所をつけると導入できる
1-(2)遺伝子導入
遺伝子DNAは二本鎖でゲノムに存在
GTAATCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTG………GCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAACTTG
CATTAGATACTGGTACTAATGCCTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTTGCAGCAC………CGTAGGTAATGGTCAACCAGACCACAGTTTTTATTGAAC
プライマーのデザイン
20塩基の特異的配列を使いましょう！
Forwardプライマー：CCCGCTAGCATGACCATGATTACGGATTC
Reverseプライマー：CCCAAGCTT TTATTTTTGACACCAGACC
制限酵素が一種類だと
G
CGATC
CTAGC
G
G
CTAGC
ATG…..TAA
CGATC
G
３末端
5末端
ATG…..TAA G
CGATC
G
CGATC
3末端
二つの方向で結合してしまう！
CTAGC
G
GCTAGC
GCTAGC
ATG…..TAA
CGATC G
CGATC G
３末端
5末端
5末端
CTAGC
G
制限酵素が一種類だと
ATG………….TAA
OR
どちらの方向にも入ってしまう。
しかし、タンパク発現させるには方向が重要
T7promoter
ATG………………………………….TAA
T7terminator
1-(2)遺伝子導入
1.
2.
3.
4.
制限酵素サイトを含むプライマーでLacZ遺伝子をPCRで増幅
増幅されたPCR断片の両端を制限酵素で切断
プラスミドを二つの制限酵素で切断
DNAサイズが大きいほうだけを摘出
NheＩ
Lac遺伝子
HindIII
切断
増幅
接着
NheＩ
pET-17b
環状
（A）
Lac遺伝子
Lac遺伝子
HindIII
制限酵素反応
37度1時間
pET-17b
直鎖状
（B）
Ligation反応
16度30分
遺伝子導入
pET-17b
（C）
これらのプラスミドを大腸菌に導入(形質転換)
実際に今からやることを整理しましょう！
プラスミドの導入 1-(3)
大腸菌
ラクトースを分解
する遺伝子(LacZ)
ゲノム
遺伝子配列を増幅する(PCR)
プラスミドに組み込む 1-(2)
プラスミドを大腸菌に挿入（形質転換）
1-(3)
大腸菌
ゲノム
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
プラスミドは多コピーあるのでLac遺伝子がコードするタンパクを大量生産する
観察2-(1)、2-(2)、2-(3)
コントロール
Plasmid
（環状or直鎖状）
（0.5 ng/μl)
環状（A)
青丸
直鎖状（B)
赤丸
遺伝子導入
(C)
1μl
6μl
6μl
cDNA（断片）
2μl
10xBuffer
1μl
T4 DNA Ligase
(前に取りに来る)
1μl
計
1μl
6μl
10μl
これらのプラスミドを大腸菌へ導入
１－(２)ライゲーション
今からやること－１
１）LacZ遺伝子断片2μｌ、プラスミド6μｌ、10XBuffer1μｌ、T4 Ligase 1μｌ、水は入れない。
２）16℃で30分以上放置（何分やったかをレポートに記入）
今からやること－２
１－(1)培地の作製の続き
３）オートクレーブが終ったら、三角フラスコを振って軽くかき混ぜ、しばらくさます（手で10秒
持てるくらいまで）。
４）滅菌済みプラスチックプレートの底の端の方に、マジックで４枚には班名とA,B,C,Dと書く
（寒天培地を注ぎ込む時まで、蓋を開けない）。
５）アンピシリン(氷の中、緑丸）添加LB培地（最終濃度：50 μg/ml）のプレートを作製するため
に、三角フラスコには、25 mg/mlのアンピシリン溶液を 0.2 ml 加えて軽く撹拌する。
６）４枚のプレートに、蓋を少しずらして（完全に開くと雑菌が入る）注ぎ込む（約4 mm位の深さ
にある印まで）。注ぎ込んだらすぐに蓋をする。（100mlの培地は、プレート約５枚分なので、１
枚分程残す）
７）しばらく室温に放置して完全に固まるのを待つ（20〜30分）。固まり始めると培地の色が少
し不透明になってくるが、更にもう少し置く。固まる前に動かさない。
８）完全に固化させた後、逆さにして重ね、37℃のインキュベータ中に入れる。
修行さんからの話
注意事項を説明していただきます！
大腸菌
ラクトースを分解
する遺伝子(LacZ)
ゲノム
遺伝子配列を増幅する(PCR)
プラスミドに組み込む 1-(2)
プラスミドを大腸菌に挿入（形質転換）
1-(3)
大腸菌
ゲノム
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
プラスミドは多コピーあるのでLac遺伝子がコードするタンパクを大量生産する
観察2-(1)、2-(2)、2-(3)
1-(3)プラスミドの導入
無
pET-17b
環状（A）
pET-17b
直鎖状（B）
遺伝子導入
pET-17b（C）
（D）
• コンピテントcell: 対数増殖期の大腸菌をMg2+のイオンで処理し、冷やすことで、大腸菌の
膜透過性が上昇
• ヒートショック： 短時間（数十秒〜2分）比較的高い温度（42〜45℃）にさらすことにより、脂
質二重層の流動性が増して、プラスミドDNAが細胞内に取り込まれる。
1. 対数増殖期の大腸菌を遠心し上澄みを捨てる。
2. 形質転換試薬(Mg2+)を加え、氷で冷やしながらに細胞を懸濁
3. 大腸菌に、A:環状プラスミド（制限酵素で切断する前のプラスミド）、B:直鎖プラスミド(ライ
ゲーションする前のプラスミド)、C:遺伝子導入環状ベクター（ライゲーションしたプラスミド)
を加え、氷上に30分間置く。Dはなにも入れない、残ったもの。
4. 4本のチューブを、42℃で90秒間加温する。（プラスミド侵入）
5. LB培地を加え、37℃で30分間保温
1. 対数増殖期の大腸菌BL-21の培養液を受け取る。
2. 大腸菌培養液を軽くかき混ぜた後、1.4 mlずつ４本の微量遠心チューブに分注し、5,000
rpmで2分間遠心する。
遠心
3. 培養液を捨て、チューブを氷上で冷やしながら、ペレット（沈澱）に100μlずつ氷冷した形質
転換試薬を加える。
4. チューブ間で差が出てしまうので、4本のチューブにあるコンピテントセルを一本にまとめ
る。
混ぜる
5. Aに環状プラスミドを1μl、Bに直鎖プラスミドを6μl、Cはライゲーション済みのものにコンピテ
ントcellを100 μlずついれる。
D
A
B
C
A
B
C
D
プレートに撒く大腸菌の調整
環状（A)
直鎖上（B)
Ligation(C)
無(D)
コンピテントCell
100μl
100μl
100μl
100μl
LB培地
500μl
500μl
500μl
500μl
遠心して上澄み 遠心して上澄み 遠心して上澄み
を500μl取る を500μl取る を500μl取る
プレートに撒く
100μl
100μl
100μl
量
元のプラスミド
1/6
全量
全量
量に比べて
元々のプラスミ
0.5 ng/μl×１μl 0.5 ng/μl×6μl 0.5 ng/μl×6μl
ド量は
100μl
プラスミド無
ー
1-(3) プラスミドの導入
大腸菌
ラクトースを分解
する遺伝子(LacZ)
ゲノム
遺伝子配列を増幅する(PCR)
プラスミドに組み込む 1-(2)
プラスミドを大腸菌に挿入（形質転換）
1-(3)
大腸菌
ゲノム
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
プラスミドは多コピーあるのでLac遺伝子がコードするタンパクを大量生産する
観察2-(1)、2-(2)、2-(3)
1-(3)プラスミドの導入
プレートを裏返して、37℃のインキュ
ベータ中で一晩放置する。
考えましょう！
無数の大腸菌とプラスミド
大腸菌
アンピシリンを含むLBプレートに広げる
プラスミド
プラスミドが入っている大腸菌
だけ増殖してほしい
• 大腸菌は、抗生物質下では増殖できない。
• プラスミドには、抗生物質(アンピシリン)を分解する遺伝子が組み込
まれている。
• アンピシリンを含む培地では、プラスミドが導入されている大腸菌し
か、増殖できない。
1-(4)コロニー数のカウント
無
pET-17b
環状（A）
1μg
pET-17b
直鎖状（B）
遺伝子導入
pET-17b（C）
1μg
1μg
（D）
1μgあたり、何個のコロニーができるかを計算してください。
2日目
２．形質転換体でのタンパク質の過剰発現
Lac遺伝子とは
LacZ遺伝子β-ガラクトシダーゼ
大腸菌の栄養源
1. Glucoseが大量にあるときは、Lac遺伝子の発現が抑えられている
Lacリプレッサー
cAMP
Lac遺伝子
２．Glucoseが枯渇すると、cAMPが生産されなくなるー＞外れる
Lacリプレッサー
Lac遺伝子
３．Lactoseが存在しているときは、Laｃリプレッサーに結合してLac遺伝子から離れる
Lacリプレッサー
遺伝子発現
ラクトース結合
Lac遺伝子
４．IPTGは、ラクトースの代わりとなる
ラクトース
IPTG
今回導入したLac遺伝子の発現
- IPTG
lac リプレッサー
RNA 合成・タンパク合成は起こらない
RNA 合成酵素
＋ IPTG
IPTG
lac リプレッサー
RNA 合成・タンパク合成が起こる
RNA 合成酵素
IPTGを投与すると、Lac遺伝子がコードする、β-ガラクトシダーゼ
(116KDa)のタンパクを生産し始める。
野生株（LacZ遺伝子１個）と形質転換体（Lac遺伝子が多数個）で
生産量を比較する。
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
大腸菌タンパクを溶媒に溶かす（可溶化）
２－(1)
ポリアクリルアミドゲルを作る
ゲルを電気泳動機器にセットする
２－(2)
可溶化した大腸菌を電気で流す
２－(2)
染色、脱色
２－(2)
Image-Jを用いて定量
２－(3)
1-(4)コロニー数のカウント
無
pET-17b
環状（A）
1μg
pET-17b
直鎖状（B）
遺伝子導入
pET-17b（C）
1μg
1μg
（D）
1μgあたり、何個のコロニーができるかを計算してください。
無
pET-17b
環状（A）
1μg
pET-17b
直鎖状（B）
1μg
遺伝子導入
pET-17b（C）
1μg
（D）
• 直鎖状のプラスミドはたとえ大腸菌に入っても、抗生物質耐性にな
りません（コロニーができません）。
• 直鎖状（B)でコロニーが出ているときは、制限酵素で切れていない
ことを意味する。すなわち、（B)には(A)が含まれていることを意味し
ます。
• （C)の中にも、(A)が存在することを意味する。（A)もコロニーをできる
ので、（C)でコロニーができている全てが、遺伝子導入済みのプラス
ミドが入っているわけではない。
コロニーができた大腸菌のプラスミドには、目的の遺伝子が
入っているかの確認が必要！！
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
大腸菌タンパクを溶媒に溶かす（可溶化）
２－(1)
ポリアクリルアミドゲルを作る
ゲルを電気泳動機器にセットする
２－(2)
可溶化した大腸菌を電気で流す
２－(2)
染色、脱色
２－(2)
Image-Jを用いて定量
２－(3)
形質転換済みの大腸菌を増殖
1. 各コロニーの大腸菌を増やす（ビデオ）
2. 大腸菌の中にあるプラスミド抽出する
3. 導入前後の場所をPCRで増幅
PCRで増幅
PCRで増幅
電気泳動
ー
小さいものほど
早く泳動される
＋
4. 遺伝子が導入してあるプラスミドはバンドサイズが大きい
プラスミド抽出PCR
C
A
B
D
E
A
F
B
C
D
37度 振盪培養
電気泳動
目的の遺伝子が入っているかプラスミドが
形質転換されている大腸菌をGET！
目的の遺伝子がコードするタンパクを確認
E
F
1h 37度培養
100μl
IPTG
投与
無
3h 培養
A
Overnight
野生型
37度 振盪培養
LB培地 1h 37度培養
5ml
1h 37度培養
100μl
IPTG
投与
有
IPTG
投与
無
3h 培養
B
3h 培養
C
Overnight
形質転換体
37度 振盪培養
LB培地 1h 37度培養
5ml
IPTG
投与
有
3h 培養
D
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
大腸菌タンパクを溶媒に溶かす（可溶化）
２－(1)
ポリアクリルアミドゲルを作る
ゲルを電気泳動機器にセットする
２－(2)
可溶化した大腸菌を電気で流す
２－(2)
染色、脱色
２－(2)
Image-Jを用いて定量
２－(3)
大腸菌タンパクを溶媒に溶かす（可溶化）
電気泳動用SDS試薬に入っているもの
• SDS：タンパク質を編成させ、タンパクの主鎖と結合し、絡まないようにする。
• ２－Mercaptoetanol：S-S結合を切断する
• 熱で疎水性の領域を外側に出す
全体が負電荷を帯びた伸びた状態にする
熱
疎水性部分が外側に出て伸びた状態にする
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
大腸菌タンパクを溶媒に溶かす（可溶化）
２－(1)
ポリアクリルアミドゲルを作る
ゲルを電気泳動機器にセットする
２－(2)
可溶化した大腸菌を電気で流す
２－(2)
染色、脱色
２－(2)
Image-Jを用いて定量
２－(3)
コーム
コーム
ゲル
ゲル
上のクリップを外した後
シリコンを外す
コーム
コーム
コームを外す
ゲル
下のクリップを外す
電気泳動層に設置し、電極液で満たす
ポリアクリルアミドゲルの架橋構造
H2 C
CH
C H2
CH
(C H 2
C H)n
CO
N H2
アクリルアミド
重合
C CH
H2
(C H 2
C H)n
CO
CO
NH
NH 2
C H2
CO
＋
H2 C
TEMED
APS
C H2
CH
(C H 2
C H)n
C H2
CH
(C H 2
C H)n
CO
CO
CO
H
C
NH
NH 2
NH 2
CO
C H2
NH
NH
C H2
CO
NH
C H2
CH
(C H 2
C H)n
C H2
CH
(C H 2
C H)n
C H2
C H2
CO
H2 C
CO
CO
CO
NH 2
NH
NH 2
CH
N,N`ビスアクリルアミド
C H2
ポリアクリルアミドゲル
ポリアクリルアミドの分子ふるい効果を用いて分子量に応じて分離する。
分子ふるい効果とは・・・
網の目状の支持体
（ポリアクリルアミド）
・電荷が大きい
・網の目を通りやすい形
・分子量が小さい
分子の移動度が大きい
タンパク分子の電荷と形を一定にすれば分子量に応じた分離ができる
D
C
B
マーカー
A
ウェル
SDS-PAGEの模式図
ー
上部泳動用緩衝液：
Tris-Glycine-SDS(pH8.3）
蛋白を濃縮する
濃縮ゲル：
Tris-HCl（pH6.8）,SDS
蛋白を分離する
分離ゲル：
Tris-HCl（pH8.8）,SDS
下部泳動用緩衝液：
Tris-Glycine-SDS(pH8.3）
＋
Laemmli法の溶液系
何V、何A、何分泳動しているか？
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
大腸菌タンパクを溶媒に溶かす（可溶化）
２－(1)
ポリアクリルアミドゲルを作る
ゲルを電気泳動機器にセットする
２－(2)
可溶化した大腸菌を電気で流す
２－(2)
染色、脱色
２－(2)
Image-Jを用いて定量
２－(3)
プラスミドが入り大腸菌のみが増殖する培地で形質転換済みの大腸菌を選抜
1-(1)、1-(3)、1-(4)
形質転換済みの大腸菌を増殖
大腸菌タンパクを溶媒に溶かす（可溶化）
２－(1)
ポリアクリルアミドゲルを作る
ゲルを電気泳動機器にセットする
２－(2)
可溶化した大腸菌を電気で流す
２－(2)
染色、脱色
２－(2)
Image-Jを用いて定量
２－(3)
ゲルを流して染色した結果
ゲルを染色した結果
文章の書き方
大腸菌で遺伝子組換え体を作り、大腸菌に組み込ませた遺伝子にコードされるタンパク質を
過剰に発現させ、過剰発現させるために「ベクター」として広く使われている核酸分子であるプ
ラスミドに特有の遺伝子を組み込ませ、プラスミドごと遺伝子を大腸菌に導入(形質転換）した
遺伝子組換え大腸菌を作成し、組み込ませた遺伝子をコードするタンパク質が遺伝子組換え
大腸菌で過剰に発現しているかを確認する。
• （私たちは）大腸菌で遺伝子組換え体を作る。
• （私たちは）大腸菌に組み込ませた遺伝子にコードされるタンパク質を過剰に発現させる。
• (多くの人が）過剰発現させるために「ベクター」として広く使われている核酸分子であるプ
ラスミドを使った。
• （私たちは）そのプラスミドに特有の遺伝子を組み込ませた。
• （私たちは）組み込ませたプラスミドを大腸菌に導入(形質転換）し、遺伝子組換え大腸菌
を作成した。
• （私たちは）その遺伝子にコードされるタンパク質が遺伝子組換え大腸菌で過剰に発現し
ているかを確認した。
「レポート課題」
表紙 「題名」、「組名」、「班名」、「学籍番号」、「名前」
実習をやる前の自分がみて、読んだらすぐにわかるレポートを書いてください。
「形質転換体の作製」
・序章：具体的な目的
・方法：手順を書く（プライマーの構築方法、A,B,C,Dの違いなど明確に）
・結果：コロニーの数
・考察：コロニーの数が違う理由
「形質転換体でのタンパク質の過剰発現」
・序章：具体的な目的
・方法：手順を書く（準備したサンプルの作り方、特に、形質転換体を確認するための方法
をまとめよ。SDSのゲルの作り方も簡便に）
・結果：ゲルの写真と定量した結果
・考察：IPTGの効果および形質転換体の効果を考慮して、β-ガラクトシダーゼ酵素タンパク
の量が違う理由
１）抗生物質耐性遺伝子の役割を答えよ。
２）遺伝子をpET-17bプラスミドに導入する際のプライマーをデザインせよ。
３）プラスミドを切断するときに制限酵素を2種類使っている理由を答えよ。
４）SDS-PAGEによって分画された一部がβ-ガラクトシダーゼ酵素タンパクであることを確定す
るための方法を調べよ。
５）感想（わかりにくかった点、わかりやすかった点）
Googleで九工大 花田 と検索