Transcript 核酸等温扩增技术（三）

LAMP的优点
 操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，产
物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。
对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶
就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
 快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避
免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内
均可完成。
 高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特
异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能
进行核酸扩增。故其特异性极高。
 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR
高出数量级的差异。
LAMP的缺点
•由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最
好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能
进行长链DNA的扩增。
•由于灵敏度高。极易污染而产生假阳性结果。
故要特别注意严谨操作。
•在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均
逊色于传统的PCR方法。
•引物设计复杂。
依赖于核酸序列的扩增
 依赖于核酸序列的扩增（nucleic-acid
sequence-based amplification, NASBA)是一项
以RNA为模板的快速等温扩增技术。
 由加拿大Can-gene公司1991年首先发明。
 主要用于RNA检测，具有高度敏感性和特异
性。
NASBA技术原理
 NASBA技术是由2个引物介导的、连续均一的
特异性体外等温扩增核酸序列的酶促反应。
 反应主要依赖于AMV逆转录酶、RNase H、
T7 RNA聚合酶和2个特殊设计的引物。
 其中引物1长度为45个碱基左右，3’端约20个
碱基与靶序列互补，5’端具有被T7 RNA聚合
酶识别的启动子序列；引物2长约20个碱基，
5’端与靶序列RNA相同。
NASBA扩增过程
NASBA反应分为2个作用相：非循环相和循环相。
非循环相：引物1与模板RNA结合，经AMV逆转录
合成一条cDNA，形成DNA-RNA杂合体，RNase H
将杂合体中的RNA降解。引物2再与单链DNA结
合，AMV催化合成双链DNA。引物1带有T7 RNA
聚合酶的识别位点，T7 RNA聚合酶以DNA链为模
板合成RNA。然后由此进入循环相。
产物检测
 电泳分析
 杂交技术
 电化学发光
NASBA技术的优点
等温扩增
快速高效
特异性高
灵敏度高
设备简单
NASBA的缺点
 扩增长度受到限制
最适长度一般为100—250bp
 随着检测技术的发展扩增产物对检测技术提出了更高
的要求。
 酶不耐热。
 扩增产物是单链ＲＮＡ，后续操作较复杂．