Transcript 临床聚合酶链反应试剂盒的选用和质检中山大学朱振宇教授

中山大学中山医学院
朱振宇 教授、博士生导师
020-87330640（O）
PCR 技 术 最 早 由 美 国
Cetus公司人类遗传研究室
Kary Mullis及同事于1985
年发现并研制成功
Kary Mullis 因 发 明 了
“聚合酶链式反应”而获
得1993年度诺贝尔化学奖 。
Kary Mullis
PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存
在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整
个扩增过程分变性、退火、延伸三步。经过若干
循环后使目的DNA得以迅速扩增。
PCR技术自1989年开始被应用于临床检验
以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地
成为临床实验诊断学的一个技术热点.目前，
临床PCR检验已经广泛使用商品化、规范化的
试剂盒
● PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而
且是至关重要的
● 试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制
诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包
装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的
质量有决定性的影响
如何选择质量好的且符合自己实验室要的
试剂盒？
●
●
如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量?
PCR或RT-PCR试剂盒的组成
●核酸提取试剂
●核酸扩增或反转录－核酸扩增试剂
●产物检测试剂
影响PCR试剂盒质量的因素
●标本处理（核酸提取）方法、用于核酸扩
增的原材料及方法学设计
●运输和贮存中所存在的问题
核酸提取方法
●经典方法：酚－氯仿抽提法，提取效率高、纯度
好，但过程繁琐，易增加标本间相互污染的机会
●简便方法：煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等
核酸提取除了要求操作简便外，更重要的是提取的
效率及纯度，因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替
代。
核酸提取的效率及纯度的检测
使用已知阳性（包括病毒含量）的溶血和脂血
血清标本，用试剂盒提供的标本处理方法提取核
酸后扩增检测，与无溶血和脂血的血清标本比较，
观察测定结果的差异，从而判断提取方法的优劣。
核酸扩增所需的原材料
●寡核苷酸引物
●扩增缓冲液
●dNTP
●Taq酶以及反转录酶等
寡核苷酸引物和探针
●引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响
纯度
的高低可根据260/280吸光度比值来判断，如小于
2.0，则需重新纯化
●引物和探针的结合特异性
性的出现
应减少假阳性或假阴
扩增缓冲液和dNTP
●缓冲液包括：Tris-HCL(pH8.3~8.8)，KCl或
NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20
或DTT
● Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增
●四种dNTP的终浓度应相等
Taq酶以及反转录酶
●酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，
则靶序列产量很低 。
●每100μl反应液中含1～2.5U（比活性为
20U/pmol）Taq DNA聚合酶为佳
产物检测
●杂交固相：通常为聚丙烯微孔板和硝酸纤维素膜，
其质量高低直接影响产物的测定
●标记物：最常用的是辣根过氧化物酶（HRP）
试剂盒的运输和贮存
●贮存：核酸扩增部分－20℃，产物检测部分试剂
则应贮存于2～8℃
●有效期:在适当的贮存温度下，PCR试剂盒的一般
为6个月
临床PCR试剂盒的分类
●临床PCR试剂盒按其测定目的可分为定性和定量
测定两大类
●前者主要是用于未知病因患者的临床病因诊断
●后者则是用于已知患者治疗的动态观察
目前国内用于定性测定的PCR试剂盒的测定模式
主要有PCR－ELISA和PCR－膜上杂交（杂交流）和分
子信标荧光检测等；用于定量测定的试剂盒的测定
模式则主要有TaqMan和Amplisensor荧光定量以及
PCR－Elisa定量等
临床PCR试剂盒的选用原则
●参考实际生产厂家的信息广告
●参考同行对有关试剂盒的使用效果
●参考有关机构的综合评价
如何选择适用的试剂盒
●根据使用目的的选择
●根据所在实验室的技术特点选择
●根据所在地区患者的承受能力选择
临床PCR试剂盒的质检
●内外包装的检查（厂家名称、检测目的、批准文
号、批号和有效期等)，内包装的检查主要是看试剂
瓶是否漏液、真空包装是否破损、试剂是否齐全以
及是否有使用说明书等
●试剂盒测定性能的检验（采用“血清盘”进行 ）
●血清盘是由一定数量的原血清阴阳性样本、以
及3-5份系列稀释阳性样本所组成
●原血清样本可用于判断PCR试剂盒对特定病原
体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；系列
稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限
质检时，用待检PCR试剂盒测定血清盘中的各份
样本，以血清盘的结果为标准，计算被检PCR试剂盒
的灵敏度、特异性和符合率。
试剂盒评价四格表
血清盘结果
（+）
血清盘结果
（-）
被检试剂盒
结果+
a
b
a+b
被检试剂盒
结果-
c
d
c+d
a+c
b+d
a+b+c+d
合计
合计
表中a为真阳性，b为假阳性，各项指标的计算公式
如下：
特异性（%）=d/b+d×100%
灵敏度（%）=a/a+c×100％
符合率（%）=a+d/a+b+c+d×100％
理想情况下，试剂盒的特异性、灵敏度及符合率应
为100%。
此外，也可采用弱阳性（低拷贝数）质控物进行质
检
对不同试剂生产厂家或同一厂家不同批号试剂
盒采用同一弱阳性定值质控物检测，可比较出不同
厂家或不同批号试剂盒的测定下限的差异。在每次
临床检测中，同时带上弱阳性质控物与临床标本一
起检测，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有重要
的参考价值。