Transcript Enzyme - Diagnostik
Serumenzyme Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation
Enzyme - Eigenschaften
• Die Bestimmung von
Enzymaktivitäten
in Serum, Plasma oder Harn hat für die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen vorrangigen Stellenwert eingenommen.
• Die
Menge
von Enzymen im Plasma ist
sehr gering
, wenn man sie in Konzentrationen angibt – z.B. ALAT (GPT) 100 µg/ Liter (Gesamteiweiß 60-80 g/l) • Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B. Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren – kommen in
höheren Konzentrationen
vor.
• Enzyme gelangen meistens durch die
Zellumsatz
ins Blut.
Enzyme - Eigenschaften
• Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut – z.B.
Thrombin
,
Plasmin
,
Cholinesterase
– zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen
Abfall der Aktivität
im Blut.
• Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drüsen – z.B.
Pankreasamylase
, -
lipase
– zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen
Anstieg der Aktivität
im Blut.
• Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle
LDH, GOT, GPT, CK
zeigen bei Schädigung der – z.B. Ursprungszellen einen
Anstieg der Aktivität
im Blut.
Enzyme - Eigenschaften
• Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut sezeniert wird – z.B. CHE , kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut sinkt .
• Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber nicht ins Blut abgegeben wird – z.B. CK -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut steigt.
Enzyme - Eigenschaften
• Einige Enzyme kommen als
Isoenzyme
vor – das heißt, dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor – z.B.
Lactatdehydrogenase
oder
LDH
, die als Tetramer in 5 verschiedenen Isoformen vorkommt. • Man kann die LDH
elektrophoretisch Herkunftsorgan
herauszubekommen.
trennen , um das •
LDH-1
kommt überwiegend im Herzmuskel und Erythrozyten ,
LDH-5
dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor.
• Die Isoformen sind H 4 (
LDH-1
), H 3 M (
LDH-3
), H M =Muskel) M 3 (
LDH-4
) und M 4 ( (
LDH-2
), H 2 M 2
LDH-5
) ( H= Herz;
Serumenzyme – Diagnostisches Nützen
• Das
Erscheinen
bzw.
Verschwinden
von Enzymen im bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgänge im Körper widerspiegeln. Nicht nur die
Geschwindigkeit
des An oder Absteigens eines Enzyms, sondern das
Verhältnis
von Enzymen zueinander, gibt zusätzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer Therapie.
• Es gibt verschiedene
Komponente
der Enzymkinetik, die separat betrachtet werden müssen, um ein diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren.
Enzyme – Messung der Aktivität
• Die Internationale Union für Biochemie ( Enzymaktivitäten erarbeitet.
IUB
) hat schon 1961 Empfehlungen für die optimierte Bestimmung von • Die Bedingungen für diese
optimierten Methoden
sind: • Optimaler pH-Wert • Definierte Temperatur d.h.
37 °C
• Optimale Substratkonzentration • Optimale Coenzymkonzentration • Optimale Konzentration an Aktivatoren
Enzyme – Messung der Aktivität
• Enzymaktivität wird in Einheiten/l (
U/l
) angegeben.
• 1 internationale Einheit (
U
) ist diejenige Enzymaktivität, die pro Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1 µmol Substrat katalysiert. ( Dies wird für
Plasma
und
Serum
auf 1 Liter bezogen ).
• Die Messtemperatur ist
37 °C
(definierte und validierte Referenzbereiche sind oft nur für 25 °C vorhanden!)
Enzyme - Nomenklatur
• Die Enzyme Commission (
EC
)-Nummer beschreibt die
Funktion
eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im „
Enzyme Nomenclature
“ [1972] sowie dem „
Enzyme Handbook
“ und seinen „
Supplements
“ (Springer-Verlag).
• • • • • Die
EC-Nummer
hat 4 Komponente:
Stelle 1
definiert die
Funktion
– z.B. 1 =
Oxidoreduktasen Stelle 2
definiert die
Donorgruppe
– z.B. 1 =
CH-OH Stelle 3
definiert die
Akzeptorgruppe
– z.B. 1 =
NAD(P) Stelle 4
ist die
Enzymnummer
innerhalb der Gruppe.
• Beispiel:
EC 1.1.1.71
=
Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase
oder • Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)
Enzyme - Nomenklatur
• • • • • • •
Die Hauptgruppen von Enzymen sind: 1.x.x.x – Oxidoreduktasen LDH
: EC 1.1.1.27) (z.B.
GLDH
: EC 1.4.1.3,
2.x.x.x – Transferasen
(z.B.
Gamma-GT
: EC 2.3.2.2,
ASAT/GOT
: EC 2.6.1.1,
ALAT/GPT
: EC 2.6.1.2)
3.x.x.x – Hydrolasen
(z.B.
alkalische Phosphatase
: EC 3.1.3.1,
α-Amylase
: EC 3.2.1.1,
Lipase
EC 3.1.1.3)
4.x.x.x – Lyasen
(z.B. Adenylatcyclase: EC 4.6.1.1)
5.x.x.x – Isomerasen
Isomerase: EC 5.3.1.9) (z.B. Glucose-6-Phosphat
6.x.x.x – Ligasen / Synthetasen
carboxylase: EC 6.3.4.6) (z.B. Harnstoff-
Enzyme – Messung der Aktivität
• In klinisch-chemischen
Vollautomaten
wird alles automatisch geregelt. Die
Temperierung
der Messzelle findet automatisch statt. Das Gleiche gilt für das
Pipettieren
der Reagenzien, eventuelle
Verdünnungen
und
Umrechnung
der Ergebnisse. • Es gibt verschiedene Messmöglichkeiten: kontinuierliche Verfahren (Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt Messung) oder Endpunktverfahren .
Enzyme – Berechnung der Aktivität Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten -
• Die
Konzentration
der zumessenden Substanz in der Probe errechnet sich nach der Gleichung: •
c = ( ΔE / [
µmol * d ])
• • • •
c
=
Konzentration
der
Substanz ΔE
=
Extinktionsdifferenz Leerwert
bzw. zwischen
Extinktionsdifferenz Analysen-
durch und
Verbrauch
oder
Bildung
von
NAD(P)H d
=
Schichtdicke µmol
der
Kuvette
in = spezifischer mikromolare
cm Extinktionskoeffizient
Enzyme – Berechnung der Aktivität
• • • • Die
Enzymaktivität Konzentration
von entspricht der
Änderung Substrat
oder
Produkt
der während der
Messzeit
(t).
Meist wird bei einer
Enzymaktivitäts bestimmung
aus mehreren Messungen das durchschnittliche
ΔΕ/Minute
ermittelt. Von diesen Beobachtungen haben wir:
Volumenaktivität
=
Δc / t = µmol/min * ml Messlösung ΔE / ( t *
µmol * d ) Δc
=
Änderung
Produkt der
Konzentration
von
Substrat
oder
t
=
Messzeit
in
Minuten
Enzyme – Berechnung der Aktivität
• • • • Ein
Substratumsatz
von
1 µmol/min
=
1U
. Analog zur Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das
Volumen
der
Messlösung
und das
Probenvolumen
berücksichtigen.
Volumenaktivität = ΔE * V/ ( t *
µmol * d * v ) U/ml V
=
Volumen
der
Messlösung
zu
v
=
Volumen
, das in dem Test eingesetzten
Probe
• Da man Ergebnisse meistens in
U/l
angibt, muss man mal mit dem
Faktor 1000
multiplizieren .
• Wird
verdünntes Material
berücksichtigt werden.
eingesetzt, muss dies auch
Serumenzyme - Herkunft
•
Sekretionsenzyme – Cholinesterasen
•
Reaktion: Acylcholin + H 2 O
Cholin + R.COOH
• Es gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre
Acetyl(thio)cholinesterase
(
AChE
) (2 Typen bekannt) und die
Pseudocholinesterasen
(
CHE
) (Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere Acylcholine sowie Thiocholine spalten. • Die Bestimmung von
AChE
hat – im Gegensatz zur
CHE
– so gut wie keine klinische Bedeutung . Die
CHE
biologische Halbwertzeit im Serum beträgt ca.
10 Tage
.
Cholinesterase – diagnostisches Nutzen
• • • Aktivitätsänderungen bei der
Cholinesterase: Erhöhung
bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frühform der alkoholischen Leberschädigung), funktionelle Hyperbilirubinämie, Hypertriglyceridämie, Adipositas, Diabetes mellitus.
Erniedrigung
bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin, Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6 Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikämie, Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva, Malignome, Anämien)
Weitere Serumenzyme – Beispiele und diagnostische Anwendung in der Gerinnung
• Andere Enzyme mit Aktivität im Plasma sind die, die mit der
Blutgerinnung
zu tun haben. Hierzu gehören u.a.
Urokinase
, Gewebetyp Plasminogenaktivator (
t-PA
) und
Thrombin
sowie die überwiegende Zahl der
Gerinnungsfaktoren
, die je in einer inaktiven Form vorliegen, die während des Gerinnungsprozesses stufenweise aktiviert werden. • Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern ihre biologische Aktivität im Form von
„globalen“ Tests
, wie der
Quick-Wert
[ auch
Thromboplastinzeit
,
TPZ
oder P
rothrombinzeit
genannt Faktoren II, V, VII, X ]. Hier werden eine sowie Vitamin-K und Verminderung Fibrinogen erfasst der . Der
Quick-Wert
wird u.a. zur Kontrolle einer
Cumarin-Derivat Antikoagulantientherapie
angewendet. Die Werte werden normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben (
Normal: 70-130%
).
Serumenzyme – als Globalteste in der Gerinnung
• • • Andere
Globalteste
(mit ähnlichen Abkürzungen!) sind:
Partielle Thromboplastinzeit [PTT] partielle Thromboplastinzeit [aPTT]
und
aktivierte
– Prüft die Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I). Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMW Kininogen durch den Zusatz von Oberflächenaktivatoren, wie Kaolin.
Plasma Thrombinzeit [PTZ]
um ein
Fibrinogenmangel
– Die PTZ wird eingesetzt, zu prüfen.
Enzyme – Messung der Aktivität Kinetisch-Optischer Test - IFCC Methode
•
Die Bestimmung der LDH Aktivität im Serum.
• Reaktion:
Lactat
+ NAD +
Pyruvat
+ NADH + H + • Messprinzip: Die
Zunahme
der
Entstehen
des
Coenzyms Extinktion NADH
durch das bei 339 nm im Spektralphotometer.
• Als
Substrat
dient
Lactat
.
• Im Prinzip kann man die Reaktion in die entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im Überschuss haben und einen anderen pH Wert einstellen. • NAD + - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form • NADH – NAD reduzierte Form
Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion
• • • Die Bestimmung des
ASAT ASAT
(
GOT
) im Serum – Aspartat-Amino-Transferase
GOT
– Glutamat-Oxalacetat-Transaminase • • Reaktion: Enzym
ASAT/GOT L-Aspartat
+ α-Oxoglutarat
L-Glutamat
+ Oxalacetat • • Indikatorreaktion: Enzym
/Malatdehydrogenase Oxalacetat
+ NADH + H +
Malat
– NAD + • Messprinzip – (
Oxydation Abnahme
des
NADH
) der
Extinktion
bei 334 nm
Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfs und Indikatorreaktion
• Bestimmung der
Creatinkinase
(
CK
) im Serum: • Reaktion: Enzym
Creatinkinase
•
Creatinphosphat
+ ADP Creatin • Hilfsreaktion: Enzym
Hexokinase
+
ATP
• •
ATP
+ D-Glucose ADP +
D-Glucose-6-Phosphat
• Indikatorreaktion: Enzym
G-6-P-dehydrogenase G-6-P
+ NADP + 6-Phosphogluconat +
NADPH
+ H + • Messprinzip: Messung der
Extinktionszunahme
(Reduktion des NADP zu
NADPH
) bei
334
nm
IFCC Methode – Creatin Kinase
• • • • • • • • •
Messbedingungen für die CK Temperatur
: 37,0 °C ± 0,1 °C
Wellenlänge
: 339 nm ± 1 nm
Bandbreite
: 2 nm
Lichtweg
(in der Kuvette): 10,00 mm ± 0,01 mm
Inkubationszeit
: 180 s
Verzögerungszeit
: 120 s
Messinterval
: 120 s
Anzahl der Messpunkte
: mindestens 6
Enzyme – Messung der Aktivität
Verfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren Lichtes
•
Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum:
• Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP)
pNP
+ PO4 • pNPP ist farblos ;
pNP
dagegen gelb bei pH 10 • • Messprinzip:
AP
katalysiert die
Hydrolyse 9,8
unter
Zunahme
von
pNPP
der Farbe (
Extinktion
) bei
405
bei
pH
nm) • Kontinuierliche (
kinetische
) Messung • Als
Cofaktoren
werden
Mg +2
und
Ca +2
benötigt
EDTA bzw. Citratplasma können, wegen ihrer komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden
.
Enzyme - Diagnostik
• •
GPT / ALAT
• Wird zur
Lebererkrankungs-Diagnostik
eingesetzt
GPT
ist überwiegend im Z
ytoplasma
der
Leberparenchymzellen
zu finden.
• • •
Wichtigster
• in kleinen Mengen auch in der
Niere
,
Herz Skelettmuskulatur
und
Störungen
– Leberzellnekroseparameter
Stark lipämische Seren
analysiert werden.
können
nicht Referenzbereiche: (37 °C) – m: <41; f: <31 U/l
Enzyme - Diagnostik
• • • • •
GOT / ASAT
• Wird zur
Lebererkrankungs-Diagnostik
•
GOT
ist überwiegend in der
Leber Skelettmuskulatur
zu finden • in kleinen Mengen auch im
Gehirn
eingesetzt sowie im
Herz- und Wichtiger
Leberzellnekroseparameter, in Verbindung mit der
GPT
Hinweis auf die Schwere der Leberzellschädigung.
Erhöhte Werte: akuter und chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Fettleber, aber auch Herzinfarkt und Muskeldystrophie. Störungen
–
Stark lipämische Seren
analysiert werden.
können
Referenzbereiche: (37 °C) – m: <38; f: <32 U/l nicht
Enzyme - Diagnostik
• • •
Laktatdehydrogenase - LDH LDH
kommt in allen Geweben vor, wobei sich die höchste Aktivität in Skelettmuskulatur, Herzmuskel, Niere, Gehirn und Leber findet • • • Aufgrund der fehlenden Organspezifität eignet sich die
Gesamt-LDH
allein nur wenig als diagnostischer Parameter.
LDH-1
als „
Spätindikator
“ für einen
Herzinfarkt LDH
erhöht bei: hämolytische Anämien, Lungenembolie Skelettmuskelerkrankungen • • Leber und Gallenwegserkrankungen
(LDH-5):
akute Hepatitis, akute Parenchymzellschädigung durch Intoxicationen
Störungen
werden. –
Hämolytische Seren
können
nicht
analysiert
IFCC Referenzmethode (37 °C) - m: <225; f: <215 U/l
Enzyme - Diagnostik
•
Glutamatdehydrogenase - GLDH
• Wird zur
Leber-Diagnostik
eingesetzt, da
GLDH
ausschließlich
intramitochondrial
in Leber vorkommt. • Ein starker Anstieg der
GLDH
weist immer auf eine schwere
Leberschädigung
hin, insbesondere der zentroazinären Abschnitte, z.B. bei akuter Stauungsleber.
• Reaktion: • • α-Oxoglutarat +
NADH
+ NH 4 L-Glutamat +
NAD Referenzbereiche: (37 °C) – m: <6,4; f: <3,8 U/l +
+ H 2 O
Enzyme - Diagnostik
• • • • • •
Gamma-Glutamyltransferase – γGT γGT
findet sich in der
Leber
überwiegend in den kanalikulären Segmenten der Hepatozytenmembran und in den Epithelien der
intrahepatischen Gallenwege
.
γGT
ist ein
Leberzellnekrose-
und
Cholestaseparameter Reaktion
:
γ-Glutamyl-p-Nitroanilid
(farblos) + Glycylglycin γ Glutamyl-Glycylglycid +
p-Nitroanilin
(gelb) (
405
nm)
Referenzbereiche: (37 °C) – m: <49; f: <32 U/l
Enzyme - Diagnostik
• •
Alkalische Phosphatase - AP
•
Cholestaseparameter
und
Knochenerkrankungen
mit erhöhter Osteoblastenaktivität • • Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP. Die Aktivität im Normalserum ist hauptsächlich auf das Leber und Knochenisoenzym zurückzuführen.
Störungen Citrat
und
EDTA Serum
bzw.
Heparinplasma,
nicht verwenden.
Referenzbereiche: (37 °C) – m: <270; f: <240 U/l
. Kinder in Wachstumsalter haben höhere Werte (Knochenbau)
Enzyme - Diagnostik
• Bei
Cholestase
steigen
AP
und
-GT
im Serum an.
• • erhöhte gesamt
AP
kommt auch bei andere Erkrankungen vor: Osteopathie mit erhöhter Osteoblastenaktivität, Nierenerkrankungen, Rachitis, Schwangerschaft (letztes Trimenon), maligne Tumoren.
GT Erhöhungen
im Serum sind bei etwa 95% aller Fälle durch eine hepatobiliären Erkrankung zustande • gekommen.
-GT
ist ein guter Marker für Alkoholabusus • Mäßig erhöhte
-GT
kommt bei einer chronisch aktiven Hepatitis, primär biliäre Zirrhose und chronische Pankreatitis vor.
Bedeutung von Quotientenbildung
•
De-Ritis Quotient = GOT/GPT
- akute Virushepatitis: < 0,7 unkompliziert, >0,7 nekrotisierend - chronische Hepatitis, Leberzirrhose: ca.1
- nicht hepatisch (Trauma/Herzinfarkt): >1 • Quotient
(GOT+GPT)/GLDH
gilt als Maßstab für den Schweregrad der Hepatozytenschädigung. < 20 bei schwerer Schädigung 20 – 50 bei mäßiger Schädigung
Bedeutung von Quotientenbildung
• Beispiele von Quotienten bei einer
Hepatitis-A
• Typischer ikterischer Verlauf /
cholestatischer Verlauf
Wochen 1 3 5 7
AST/ALT 25 °C
37 °C
0,54 /
0,49
0,54 /
0,49
(AST +ALT)/ GLDH 116 /
93
174 /
140
0,28 /
0,28
0,28 /
0,28
107 /
109
160 /
164
0,31 /
0,36
0,31 /
0,36
49 /
200
74 /
300
0,65 /
0,31
0,66 /
0,31
38 /
88
57 /
132
Enzyme - Diagnostik
• • • • • •
Creatinkinase - CK CK
kommt in hoher Aktivität in der
Skelettmuskulatur,
im
Herzmuskel
und im
Gehirn 3 Isoenzyme: CK-MB
(Myokardtyp),
und CK-BB
(Gehirntyp)
CK-MM
(Muskeltyp)
Skelettmuskelerkrankungen:
Rhabdomyolyse, Myositis, progressive Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma (inkl. i.m. Injektionen)
Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt
(Diagnostik und Verlaufskontrolle), Kontrolle einer Thrombolysetherapie, Myokarditis
Referenzbereiche: (37 °C) – m: <170; f: <145 U/l
Enzyme - Diagnostik beim Herzinfarkt
• • • • • •
CK-MB
erreicht im Myokard ihre höchste Konzentration • Obwohl
CK-MB
nicht vollständig kardiospezifisch ist, wird sie in Verbindung mit der
Gesamt-CK
neben den kardialen
Troponinen
weiterhin als biochemischer Marker für den
akuten Herzinfarkt
eingesetzt.
Cardiac-Troponin-T
standardisiert - Methode der Wahl, da
Cardiac-Troponin-I Troponin-C
ist nicht spezifisch genug für die Herzinfarktdiagnostik.
CK,CK-MB
Infarkt.
und
Troponin T
steigen
2-6 h
nach einem
Myoglobin
nach
6-12 h
; nach 1-2 h;
GOT
nach
4-6 h
;
LDH-1
(
HBDH
)
Serumenzyme – Referenzbereiche für gesunde Erwachsene – 37 °C
• • • • • • • • •
-GT AP
– – M: < 50 U/l; M: 40-120 U/l; F: < 32 U/L (
IFCC
) F: 30-90 U/L
GPT GOT
– – M: < 40 U/L; M: < 43 U/L; F: < 33 U/L F: < 36 U/L
CK
– M: 24-207 U/L;
CK-MB
– F: 24-170 U/L M: < 18 U/L; F: < 18 U/L ( ( (
IFCC mit P-5-P IFCC mit P-5-P IFCC
)
GLDH LDH
– – M: < 6,7 U/L; M: 135-225 U/L;
LDH-1 (HBDH)
– F: < 4,8 U/L F: 135-215 U/L ( M: < 171 U/L ;
IFCC
F: < 202 U/L ) ) ) •
(Wood et al.: Clin Lab 2004; 50: 455-75)