Transcript Vybrané metody ACh

Vybrané metody ACh
KAPALINOVÁ
CHROMATOGRAFIE
Kapalinová chromatografie (LC)

Nejdéle známá chromatografická metoda
(Cvět). Téměř 80% známých látek lze
analyzovat pomocí LC (iontové, polární i
nepolární, mol.hm. 5-106)

Papírová chromatografie (PC) je starší technika
a byla postupně nahrazena tenkovrstevnou
chromatografií (TLC).

Pro obě techniky je stacionární fáze umístěna v
ploše. V případě PC je tvořena speciálním
papírem, u TLC tenkou vrstvou fáze na desce
(sklo, hliníková či plastová folie)
PC a TLC – stacionární fáze


V PC je stacionární fází voda sorbovaná na
papíře
V TLC stejné materiály jako v kolonové
chromatografii
Pro lipofilní – adsorbenty oxid hlinitý (alumina),
silikagel, polyamid, acetylovaná celulóza
 Pro hydrofilní – celulóza, měniče iontů, křemelina,
polyamidy a chemicky vázané fáze


Desky pro TLC lze připravit v laboratoři,
přednost se dává komerčně připraveným
deskám pro klasickou TLC, HPTLC či
preparativní TLC
PC a TLC – stacionární fáze

Vrstva fáze (0,1 -0,5 mm pro analytické a 0,5 -2,0
pro preparativní účely)je nanesena na skleněné,
hliníkové nebo plastové desce.




Přilnavost k desce se zvyšuje přídavkem pojiva 0,1-10%
(sádra, škrob, polyakrylová kyselina a její soli)
Pro snadnější vizualizaci skvrn se často přidává
fluorescenční indikátor např. aktivovaný křemičitan
hořečnatý o stejném zrnění (analyt zháší fluorescenci)
Někdy stacionární fázi na desce předchází tzv.
koncentrační zóna (2-3cm) tvořená inertním
sorbentem
Pro HPTLC se používají menší sférické částice (210μm)s jednotnou velikostí nebo monolitické
ultratenké vrstvy – vysoká účinnost, délku lze
zkrátit na několik cm, vyšší citlivost (pg)
PC – mobilní fáze

Jako mobilní fáze v PC se používají směsi
rozpouštědel v závislosti na struktuře analytu.



Pro polární látky se často používají směsi butanolkyselina octová (hydroxid amonný)-voda
Pro středně polární butylacetát, diisopropylether,
chloroform s malým přídavkem polárních rozpouštědel
a vody
Pro zcela nepolární látky papír impregnovaný
parafinovým olejem a vodné roztoky alkoholů nasycené
stacionární fází jako mobilní fáze (RP-PC).
TLC – mobilní fáze

O volbě mobilní fáze v TLC rozhoduje
použitá stacionární fáze
Pro dělení na adsorpčním principu a chemicky
vázaných fázích se volí rozpouštědla podle
eluční schopnosti – eluotropní řady (n-pentan
,……., voda)
 Pro měniče iontů elektrolyty
 Pro gely voda nebo organická rozpouštědla

PC a TLC - vyvíjení



Vzorek se nanese ve formě malých skvrn na
start pomocí mikropipetky, mikrostříkačky a
nechá se odpařit rozpouštědlo
Uspořádání vzestupné, sestupné (PC),
kruhové v komoře nasycené parami
rozpouštědel – rozpouštědlo vzlíná
kapilárními silami. V HPTCL deska v
hermetické „komoře“ s kontrolovaným
přetlakem
Vyvíjení



jednoduché (v jedné soustavě)
vícenásobné – aplikují se různé mobilní fáze, na čele
nové mobilní fáze dojde k zakoncentrování
dvojrozměrné – skvrna se vyvine v jednom směru,
deska se vysuší a otočí o 90° a vyvíjí se v jiné
soustavě
PC a TLC – vyhodnocování kvality

Pokud nejsou dělené látky barevné, je
nutno skvrny vizualizovat.



Postřik činidlem, nebo namočení do
roztoku který poskytuje barevnou reakci
(nespecifická – páry jódu, konc. kyselina
sírová, acidobazické indikátory pro kyseliny
a zásady, specifická pro funkční skupiny)
Pozorování v UV záření – fluorescence či
její zhášení na deskách s indikátorem (254
nebo 366nm)
Základní veličina, která charakterizuje
polohu separovaných zón je retardační
faktor RF definovaný jako poměr
vzdáleností, které urazil analyt di a čelo
mobilní fáze dm
RF = di/dm= ui/um = 1/(1+k)
u – příslušné rychlosti, k- retenční faktor
PC a TLC – vyhodnocování kvality


Hodnota RF se pohybuje od 0 (látka nemigruje) do 1 (látka
není zadržována a migruje s čelem rozpouštědla)
Hodnoty RF jsou špatně reprodukovatelné





Stacionární, mobilní fáze a páry nejsou v rovnováze
Kapilární síly záleží na průměru kanálků – průtok není konstantní
Látky se v PC a TLC vyhodnocují na základě RF hodnot a
jejich shodě se standardy
Využívají se také hodnoty RM definované
RM = log[(1/RF)-1 ]= log k
hodnoty RM souvisejí se strukturou, v homologických
řadách závisí lineárně na počtu strukturních jednotek
Pro kruhové vyvíjení platí RF,lineární =R2F,kruhový.
PC a TLC – vyhodnocování kvantity

Metody přímé




Měření plochy skvrny – logaritmus
plochy je úměrný koncentraci
Radiochemické metody –
radioaktivně značené látky
Denzitometrie – nejběžnější a
nejpřesnější – skenovací
fotodenzitometry převádějí intenzitu
skvrn na chromatogram s píky,
jejichž plocha je úměrná množství
analytu
Nepřímá metoda – skvrna se
vystřihne či vyškrábe a extrahuje a
stanoví se koncentrace
Kolonová LC


V klasickém provedení v kolonách 500 x 10mm, částice
0,05-1,0 mm + hydrostatický tlak – málo účinné, dlouhá
doba analýzy (hodiny) – dodnes pro preparativní a
jednoduchá dělení
HPLC se vyvinula z GC na počátku 70. let. Vysoké
účinnosti se dosahuje




Použitím malých částic (2-7μm) pravidelného tvaru a jednotné
velikosti
Průtok mobilní fáze musí být zajištěn vysokým tlakem (jednotky
– desítky MPa)
Lze zpracovávat malá množství (μl)
Potřeba citlivých detektorů
náročná instrumentace
Srovnání GC x HPLC

Rozdíly



Podstatně menší částice (dp) – GC
0,1-0,3 mm x HPLC 0,01 – 0,003
mm
Podstatně vyšší viskozita a hustota
mobilní fáze (Dm)
Aby bylo možno srovnávat
zavedeny redukované veličiny
h  H / dp
  u.d p / Dm
Kolony HPLC

Tradiční analytické náplňové kolony





délka 5-25 cm,
vnitřní průměr několik mm,
průtok mobilní fáze cca 1ml/min
objem vzorku 1-20 μl
částice náplně 5-10 μm, kulovitého tvaru
Během používání při vysokých tlacích se náplň
sesedá

Mikronáplňové




vnitřní průměr 1 mm a menší
částice 2-3 μm
Objem vzorku cca 1 μl
průtok mobilní fáze desítky μl/min
Lze ještě používat běžnou instrumentaci
Kolony HPLC

Kapilární náplňové




Vnitřní průměr 0,15 – 0,5 mm
Částice 2 μm a menší
Průtok mobilní fáze 1-15 μl/min
Kapilární


Vnitřní průměr 10 μm
Průtok mobilní fáze cca 1 ml/min
Vyžadují speciální instrumentaci
(čerpadla, nl-dávkovače,
detektory)

Čipová instrumentace (celý
kapalinový chromatograf na
čipu) – není dosud komerčně
dostupná
Monolitické kolony




Kompaktnější náplň než klasické náplňové kolony
Kolona je vyplněna polymerem organického či
anorganického původu o definované pórovitosti,
který se vytvoří přímo v koloně vhodnou polymerační
reakcí v roztoku
Monolitické kolony na bázi silikagelu mají vysokou
pórovitost, která dovoluje vysoké průtoky a velký
povrch pro interakce s analyty
Monolitické kolony mají větší životnost, velkou
mechanickou stabilitu, jsou odolnější ke změnám pH
a vykazují vysoké účinnosti při velkých průtocích
mobilní fáze
Separační principy v LC

Adsorpční chromatografie s
polárními sorbenty a
nepolárními mobilními fázemi je
historicky nejstarší – systém s
normálními fázemi





Analyt soutěží o aktivní místa na
povrchu adsorbentu s mobilní fází
Fyzikální adsorpce je
charakterizována slabšími
interakčními silami
Chemisorpce je nežádoucí
Silněji se sorbují polární látky
Sorpce je podporována nepolární
mobilní fází
LSC

Při velkém zředění solutu lze adsorpční děj popsat
lineární izotermou danou Henryho zákonem, při
vyšších koncentracích (preparativní HPLC)
sorpčními izotemami





Silikagel-polární sorbent (silanolové skupiny –SiOH) ,
siloxanové (Si-O-Si) jsou nežádoucí. Stabilní při pH 2-8
Alumina – stabilnější v alkalickém prostředí (pH 2-12),
vhodná pro látky bazického charakteru
Adsorbenty na bázi organických polymerů
Mobilní fáze nepolární rozpouštědla (hexan,
heptan,..) s malým množstvím (do 1%)
modifikátoru (voda, alkoholy, acetonitril,
tetrahydrofuran)
Vhodná pro separaci látek lišících se funkčními
skupinami a izomerů. Nevhodná pro dělení v
homologických řadách.
LC na chemicky vázaných fázích

Chemicky vázané fáze (hlavně nepolární-reverzní) v
součastné době nejpoužívanější






Umožňují aplikace pro analyty s širokým rozsahem polarity (80%
všech aplikací)
Široký sortiment fází
Levné mobilní fáze a rychlé ustavování rovnováhy
Reverzní chromatografie je jednodušší, rychlejší a
reprodukovatelnější
RP – umožňují přímé aplikace na biologické vzorky (vodné
roztoky)
Nevýhody



Složitý retenční mechanizmus
Chemicky vázané fáze na silikagelu jsou stabilní v omezeném
rozsahu pH (2,5-8)
Přítomnost nezreagovaných silanolových skupin vede k nežádoucí
adsorpci a je příčinou kompllikovaného mechanizmu
LC na chemicky vázaných fázích




Silikagel je nejběžnějším nosičem pro
chemicky vázané fáze – obsahuje
silanolové skupiny, ve kterých může být
aktivní vodík snadno nahrazen různými
funkčními skupinami –R. Většina fází je
siloxanového typu Si-O-Si-R
Reakcí s monochlororganosilany vznikají
fáze s monomolekulární vrstvou vázané
fáze, zatímco reakcí s di- a trichlorsilany
dochází k sesíťování a vzniku polymerní
vrstvy
v poslední době se používají i jiné
materiály jako oxid zirkoničitý a titaničitý,
které jsou stálé v širším rozsahu pH
Lze použít i polymerní nosiče, které jsou
stálé v širokém rozsahu pH, neobsahují
zbytkové aktivní skupiny, ale mohou
uplatňovat hydrofobní a vylučovací efekty
LC na chemicky vázaných fázích
RP – reversní fáze, NP – normální fáze
SEC – vylučovací chromatografie
LC na chemicky vázaných fázích

Mechanizmus separace na reversních chemicky vázaných
fázích je kombinací tří interakcí

Interakce solutu s mobilní fází (vodou) – rozhodující





Přídavkem organických rozpouštědel povrchové napětí vody klesá a
klesá i retence
Přídavkem solí povrchové napětí roste a zvyšuje se i retence
Interakce mobilní fáze se stacionární fází - při větším obsahu
organického rozpouštědla (nad 50%)jsou alkyly solvatovány a slut
reaguje s celým řetězcem
Rozdělování solutu mezi mobilní a stacionární fázi – retence roste s
množstvím vázaného uhlíku (10-60%) a délkou řetězce
Nejpoužívanější je oktadecylová fáze (RP C-18)



Lze separovat nepolární látky (voda + organická rozpouštědla)
Látky polarizovatelné a slabé kyseliny a báze (potlačit disociaci
volbou pH)
Látky iontového charakteru, přidáme li do mobilní fáze iontově
párové činidlo s opačným nábolem (laurylsulfát, tetraalkylamonné
soli,..) – tvorba asociátu – iontově párová chromatografie
Iontově výměnná chromatografie

Jako stacionární fáze se používají



Využívají s následující funkční skupiny





organické polymery
materiály na bázi silikagelu – jsou účinnější, rychleji se
ustavuje rovnováha, umožňují práci s gradientovou elucí
Karboxylová (-COOH) – slabý měnič kationtů
Sulfoskupiny (-SO3H) – silný měnič kationtů
Aminoskupina (-NH2) – slabý měnič aniontů
Tetraalkylamoniová (-N+(R)3) – silný měnič aniontů
Jako mobilní fáze se používají vodné tlumivé
roztoky, jejichž ionty jsou v dynamické rovnováze s
ionty měniče – čím větší koncentrace, tím rychlejší
eluce
Iontově výměnná chromatografie

Retenci lze ovlivňovat





Používá se pro





Koncentrací solí
Hodnotou pH
Teplotou
Přídavkem organického modifikátoru
látky iontové povahy – silné i slabé elektrolyty
Aminokyseliny – fáze ze silného katexu a C-18
Pro čištění peptidů a proteinů
některé neutrální látky lze převést na nabité ionty (komplexy diolů a
cukrů s kyselinou boritou)
Speciální případ je iontová chromatografie na silných
katexech či anexech s vodivostní detekcí. Aby byla detekce
citlivá, je nutno potlačit vodivost mobilní fáze (uhličitany
pro anionty a HCl pro kationty). Před detektor je zařazena
potlačovací ionexová kolona opačného charakteru, která
zamění disociovanou fázi za málo disociovanou- tedy málo
vodivou.
Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)



Molekuly se dělí podle své velikosti na
základě vylučovacího nebo síťového efektu
Rozhodující úlohu hraje velikost a tvar solutu
a velikost a tvar pórů stacionární fáze (gelu)
Jiné symboly pro retenční charakteristiky






Vi – objem mobilní fáze uvnitř pórů stacionární
fáze
V0 – objem mobilní fáze mezi částicemi
Vt – celkový objem mobilní fáze v kolony
Vt = V0 + Vi
Molekuly větší než objem pórů se nedostanou
do stacionární fáze a eluují v objemu VR=V0
Malé molekuly, které mohou pronikat všemi
póry eluují v celkovém objemu mobilní fáze
VR=Vt.
Ostatní látky eluují v retenčním objemu VR (V
0<VR<Vt)
Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)

Frakce objemu uvnitř pórů dosažitelná pro difúzi solutu se
nazývá distribuční konstanta K0
K0 = (VR-V0)/Vi  VR = V0 + K0Vi






Velké molekuly VR = V0 a tedy K0 = 0
malé molekuly VR= Vt a K0 = 1
 K0 (0 – 1)
Omezená separační kapacita (eluce mezi V0 a Vi).
Pro dosažení vyšší účinnosti separace nutno použít dlouhé
kolony
V případě ideálního chování v SEC (o retenci rozhoduje jen
velikost a tvar pórů sttacionární fáze a analytu), je retenční čas
(objem) přímo úměrný logaritmu molekulové hmotnosti Mr
tr = a – b log Mr
a,b - konstanty
Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)

V případě ideálního chování v
SEC (o retenci rozhoduje jen
velikost a tvar pórů stacionární
fáze a analytu), je retenční čas
(objem) přímo úměrný logaritmu
molekulové hmotnosti Mr
tr = a – b log Mr

a,b – konstanty
Odchylky od ideálního chování
jsou způsobeny interakcemi solutu
se stacionární fází (iontová
výměna, adsorpce, solvofobní
interakce) Lze je někdy eliminovat
složením mobilní fáze- přídavek
organické fáze, solí
Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)

Stacionární fáze




V klasické gelové chromatografii se používají hydrofilní zesíťované
agarosové a dextranové gely – bobtnají a jsou stlačitelné – nelze
používat v HPLC
Pro HPLC semirigidní a rigidní náplně na bázi styrendivinylbenzenového kopolymeru nebo methakrylátových polymerů
Pro biopolymery – hydrofilní polymery nebo anorganické stacionární
fáze (porézní sklo, silikagel) – nebezpečí adsorpce solutů a složek
mobilní fáze
Mobilní fáze by neměla vykazovat interakce s analyty ani
stacionární fází




Musí rozpouštět analyty (vyšší pracovní teplota)
Musí dobře smáčet povrch stacionární fáze, ale nesmí s ní interagovat
Nemá solvatovat soluty – zvýšení jejich zdánlivé molekulové hmotnosti
Kompatibilní s detektorem (pro UV nelze používat aromáty)
Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)

SEC se využívá hlavně pro vysokomolekulární
látky v polymerní chemii a biochemii s
molekulovou hmotností nad 2 000.
Pro předseparaci komplexních vzorků (štěpných
produktů proteinů s tripsinem)
 Oddělení nízkomolekulárních látek od
vysokomolekulárních (gelová filtrace)
 Určení molekulové hmotnosti látek a její distribuce

Afinitní (biospecifická) chromatografie




Je založena na silných biospecifických
interakcích analytů s
komplementárními látkami (ligandy) –
interakce enzymů s inhibitory,
substráty,kofaktory či efektory,
komplexy protilátek s antigeny atd.
Stacionární fáze- nosič s kovalentně
navázaným ligandem (afinantem)
Na takovou fázi se ze vzorku zadrží
pouze látky s komplementární vazbou,
ostatní se eluují s mrtvým časem
Analyt se z vazby na ligand uvolní
změnou pH, koncentrace solí, změnou
teploty, přídavkem činidel
Volba separačního systému
Instrumentace v HPLC
Čerpadla


Pro kapilární kolony nl/min
Pro mikronáplňové μl/min
Čerpadla


Pro běžné náplňové kolem 1ml/min
Pro preparativní desítky ml/min
Gradient mobilní fáze

Odplyněné mobilní fáze přes filtr



Snížený tlak
Ultrazvuk
Probublávání heliem
Dávkování
Spektrofotometrické detektory
Fluorescenční detektor
Refraktometrický detektor
Refraktometrický detektor
Detektory pro HPLC


Detektor založený na rozptylu světla s odpařením
mobilní fáze (ELS – evaporative light scattering
detektor) . Použití je omezeno na netěkavé analyty
a těkavé mobilní fáze – universální detektor
Elektrochemické detektory (aminy, fenoly, …)



Měření vodivosti pro iontové látky
Měření elektrického proudu elektrochemického děje
(oxidace, redukce)
Pracovní elektrody




Ušlechtilý kov Au, Pt
Různé formy uhlíku pro oxidace
Rtuť a rtuťový film pro redukce
Spojení s AAS, IPC, AES, NMR, MS
Gradientová eluce

Během analýzy se mění složení mobilní fáze.
Používá se pro vzorky s velkými rozdíly v
retenčních faktorech (10 < k < 1)