Transcript Biochemie_I_2_aminokyseliny_peptidy

Biochemie I
Aminokyseliny
a peptidy
Aminokyseliny a peptidy
(vlastnosti, stanovení a reakce)
AMINOKYSELINY
Když se řekne AK
( -COOH, -NH2 nebo -NH-)
prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny:
- (=2-), -(=3-)..... -(= poslední)
-alanin: +H3N-CH2-CH2-COO-aminobutyrát (GABA): +H3N-CH2-CH2-CH2-COO-
AMINOKYSELINY
-aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera)
D:
COO
H CNH3+

R
L:
COO
NH3+ CH

R
Kódované aminokyseliny (20):  -aminokyseliny (kromě prolinu – NH2
skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který
nese karboxylovou skupinu.
AMINOKYSELINY
L--aminokyseliny:
kódované (= proteinogenní, viz dále)
nekódované:
- odvozené od kódovaných aminokyselin
-Tyrkatecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...)
-vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace)
- metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin)
Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá).
Esenciální: pro člověka
Název / zkratka
Glycin
Gly
Vzorec
Polarita
Esenciální
COOH C H
N
N
N
N
+
NH 3
Alanin
Ala
C OOH C CH 3
+
NH 3
Valin
Val
Leucin
Leu
COO- CH
3
H C HC
+
CH3
NH 3
COOCH3
H C CH2 HC
CH3
+
NH3
N
E
N
E
Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá).
Esenciální: pro člověka
Název / zkratka
Vzorec
COO-
Isoleucin
Ile
Esenciální
N
E
N
N
N
E
P
N
N
E
CH3
+
C OOCH 2
H C
+
CH 2
H 2N
CH 2
Prolin
Pro
COO-
Fenylalanin
Phe
Tryptofan
Trp
CH2 CH3
H C HC
NH3
Tyrosin
Tyr
Polarita
C
H
CH2
+
NH3
C OOH C CH2
OH
+
NH3
C OOH C
CH 2
+
NH 3
N
H
Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá).
Esenciální: pro člověka
Název / zkratka
Histidin
His
Vzorec
C OO-
NH
H C CH2 C
+
NH3
Serin
Ser
Polarita
Esenciální
CH
+
NH
Z
N
P
N
P
E
P
N
N
E
CH
C OO-
H C CH 2 OH
+
NH 3
Threonin
Thr
C OO-
+
NH 3
Cystein
Cys
CH 3
H C CH
OH
C OOH C CH 2 SH
+
NH 3
Methionin
Met
C OOH C CH 2 CH 2 S CH 3
+
NH 3
Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá).
Esenciální: pro člověka
Název / zkratka
Vzorec
Esenciální
COO-
Lysin
Lys
Arginin
Arg
Polarita
+
H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 3
+
NH 3
C OO-
Z
E
Z
N
K
N
K
N
P
N
P
N
+
NH2
H C CH2 CH2 CH2 HN C
+
NH2
NH
3
Asparagová
kyselina
Asp
Glutamová
kyselina
Glu
C OO H C CH 2 C OO +
NH 3
C OOH C CH 2 CH 2 C OO+
NH 3
C OO-
Asparagin
Asn
Glutamin
Gln
H C CH2 CONH2
+
C OO-
NH3
H C CH 2 CH 2 C ONH2
+
NH 3
Naučit se AK včetně označení
hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci
Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců
Funkční skupiny:








Alifatické
Aromatické
Hydroxylové
Sulfhydrylové
Kyselé
Basické
Polární
Nepolární
Hydrofobní
aminokyseliny
Polární
aminokyseliny
Kyselé
aminokyseliny
Bazické
aminokyseliny
Větvené aminokyseliny
•
•
•
•
leucin, valin, izoleucin
energetické substráty
nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata)
součástí specializovaných roztoků aminokyselin
Kódované aminokyseliny:
Jednopísmenkové zkratky
Proč jsou v tabulce vzorce s náboji?
obojetné ionty = amfionty
COO H
C
H
+
NH 3
celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v pH 7 = 2)
volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v pH 7 = 0)
Úvod do teorie elektrolytické disociace:
HA  H+ + A-
kyselina:
např.
CH3-COOH  H+ + CH3-COO-
termodynamická disociační konstanta
H  A 


+
zdánlivá
přičemž
KA
-
 HA
Ka  K A

H


.
HA
A
Ka 
a
H
.a
a HA
A
Úvod do teorie elektrolytické disociace:
B + H2O  BH+ + OH-
báze:
např:
CH3-NH2 + H2O  CH3-NH3+ + OH-
BH  OH 


+
bazická zdánlivá disociační konstanta:
ale:
Kw = [H+] . [OH-] a tedy:
po spojení: K
B


KB
[ OH  ] 
 B.[ H
-
2
O]
Kw
[H  ]

BH +  Kw
 B.[ H

].[ H 2 O ]
B][ H 


 BH .[ K ]
+
[H2O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/KB:
1
KB

w
Kyselá disociační konstanta KA ionisované formy báze B (např. CH3-NH3+)
KW
je tedy rovna:
KA 
KB
KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pKA SKUPIN
VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH
-COOH
2,5
,-COOH imidazolium
4,0
6,0
-SH
8,3
-NH3+
9,5
fenol
10,1
-NH3+ guanidinium
10,5
12,5
Hodnoty pKA disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25
oC)
Funkční
skupina
-karboxylová
,karboxylová
imidazolová
-aminová
Aminokyselin
a
C-koncová
Asp, Glu
His
N-koncová
Hodnoty pKA nalezené
ve volných
aminokyselinách
1,7 - 2,6
Hodnoty pKA
nalezené
v bílkovinách
1,8 - 3,6
3,86; 4,25
3,0 - 4,7
6,0
5,6 - 7,0
8,8 - 10,7
7,9 - 10,6
-aminová
Lys
10,53
9,4 - 11,0
sulfhydrylová
Cys
8,33
8,3 - 8,6
fenolová
Tyr
10,07
9,8 - 10,8
guanidylová
Arg
12,48
11,6 - 12,6
TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN
Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit pH, když budu přidávat NaOH?
H  A 


+
KA
-
 HA
Na začátku: jen HA, množství A- odpovídá množství přidaného louhu.
H   K
 HA
+
A
A 
-
převedeme na pH:
(Hendersonova - Hasselbalchova rovnice)
pH  pK A


 log
A
 HA
TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN
Titrační křivka glycinu
C OOH C CH 2 CH 2 C OO+
NH 3
COO+
H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 3
+
NH 3
C OO-
NH
H C CH2 C
+
NH3
CH
+
NH
CH
Cystin = cystinylcystein
Titrační křivka cystindihydrochloridu
12
10
pH
8
6
4
2
0
0
1
2
3
[NaOH]/[cystin.2HCl]
4
ISOELEKTRICKÝ BOD
DEFINICE: pH, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném
elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr);
označujeme pI
Isoionický bod: pH, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.
ISOELEKTRICKÝ BOD
př.: Gly (titruji Gly.HCl)
COOH
KA1
H C H
COO-
COOH C H
H C H
+
+
NH 3
NH 3
Z = +1 (Gly1+)
0 (Gly)
[Gly  ]
pH  pK A1  log
Gly 

KA2
NH 2
-1 (Gly-1)
pH  pK A 2

2 pH  pK A1  pK A 2
[Gly  ]
 log
Gly 


[Gly  ]
 log
Gly 


Ale v pH = pI platí: [Gly1+] = [Gly-1]
takže:
pI  ( pK A1  pK A 2 ) / 2
Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pI (nutno
načrtnout titrační křivku)
Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pKA v
okolí pI)
Isoelektrické body kódovaných aminokyselin
AK
pI
AK
pI
AK
pI
AK
pI
Gly
6,0
Ser
5,7
Phe
5,5
His
7,6
Ala
6,0
Thr
5,6
Tyr
5,7
Lys
9,6
Val
6,0
Cys
5,0
Trp
5,9
Arg
10,8
Leu
6,0
Met
5,7
Asn
5,4
Asp
3,0
Ile
6,0
Pro
6,4
Gln
5,6
Glu
3,2
OPTICKÉ VLASTNOSTI
Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm
Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1
mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm.
Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace)
1,6
3
2
1,4
absorbance
1,2
1
0,8
0,6
1
0,4
0,2
0
210
230
250
270
290
vlnová délka [nm]
310
330
Chemické reakce AK
Stanovení AK (reakce
aminoskupin): ninhydrin,
Sangerovo činidlo, dansylchlorid
Chemické reakce AK
Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita
např.
R2
R2
CO
CO
H C CH 2
OH
+ I2
H C CH 2
NH
NH
R1
R1
OH
I
značení bílkovin radioaktivním jodem
R2
R2
CO
CO
H C H 2C SH + ICH2-CONH2
H C H 2C S CH2-CONH2 + HI
NH
NH
R1
R1
blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků)
Chemické reakce AK
Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby
+
H3N
CH
R1
COO-
+
+
H3N
CH
R2
COO-
+
H3N
CH
C
NH CH
R1
O
R2
COO-
Chemické reakce AK
Chemické reakce AK
Nomenklatura peptidů
N- konec (začátek), C-konec (konec)
acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin
Pozor: Ala.Tyr  Tyr.Ala
O
+
H3N
O
CH C NH CH
CH3
H2C
OH
C OO-
+
H3N
CH C NH CH
H2C
OH
CH3
C OO-
PŘIROZENÉ PEPTIDY
Zvláštnosti struktury:
·
nekódované aminokyseliny (ornithin, -alanin ...)
·
často i D-aminokyseliny
·
někdy i tzv. -peptidové vazby (Glu)
·
cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby)
·
větvené struktury
blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)
Biosynthesa
•
meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů
•
synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí
(ne na ribosomech cestou protheosynthesy)
Skupiny přirozených peptidů
·
di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...)
·
peptidové hormony (oxytocin, vasopresin....přechod k proteohormonům)
·
neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny (15 - 32 AK)
·
peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK)
·
peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny:
phalloides)
·
protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb)
polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly--L-Glu, poly--D-Glu)
Amanita
Skupiny přirozených
peptidů
URČOVÁNÍ CELKOVÉHO
AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ
AK1-AK2-AK3 ....AKn  kyselá nebo bazická hydrolysa  AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn
(určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny chromatografické dělení)
URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN
V ŘETĚZCI
Edmanovo odbourávání
URČOVÁNÍ
N-KONCOVÉ
AMINOKYSELINY
Sangerova reakce
URČOVÁNÍ
N-KONCOVÉ
AMINOKYSELINY
Edmanovo odbourávání
SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro
a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy,
karbodiimidová synthesa)
b) blokování skupin, které nemají reagovat
c) synthesa peptidové vazby
d) odblokování
Q
HN
O
CH
"
CO-X
R1 R10
+
+
H3N
CH
"
COO-
R2 R10
+
H3N
CH
"
C
R1 R10
NH CH
"
COO-
R2 R10
+ HX
Chromatografické metody pro separaci
proteinů
• Gelová chromatografie
• Ionexová chromatografie
• Chromatografie s hydrofóbní interakcí
• Afinitní chromatografie
Ionexová chromatografie
• Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný
náboj
• Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje
• V případě proteinů hraje zásadní roli pH !
• Celulosové a dextranové ionexy
Ionexy
• Katexy – záporný náboj  vazba kationtů
silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO• Anexy – kladný náboj  vazba aniontů
slabé – diethylaminoethyl (DEAE)
silné – triethylaminoethyl (TEAE)
Ionexová chromatografie proteinů
• Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém
bodu bílkoviny
• pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na
katexu
• pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na
anexu
• pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze
provést ionexovou chromatografii
Ionexová chromatografie
• Nanášení vzorku – nízká iontová síla
• Eluce – gradientová
• Zvyšováním iontové síly
• Změnou pH
Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna
pufru
Typická ionexová chromatografie
Loading ends,
Low salt wash begins
1M
Salt gradient
0
Protein absorbance
II
III
Loading starts
Peak of
unbound
protein
Salt gradient
begins
Salt gradient
ends
I
Eluted peaks of weakly bound (I),
moderately bound (II)
and tightly bound (III) proteins
Příklad 1
Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin
(pI = 5,97), threonin (pI = 6,53) a lysin (pI = 9,74)
v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex).
V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?
C OO -
COO-
H C CH 2 C OO -
H C H
+
+
NH 3
C OO-
NH 3
CH 3
H C CH
+
NH 3
COO+
H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 3
OH
+
NH 3
Příklad 2
Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek
obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen
(isoelektrické body pI jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru pH 7,0.
V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?