Transcript Semen analizinde araştırma test prosedürleri ve genetik

Semen analizinde araştırma test
prosedürleri ve genetik testler
Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı
İstanbul Medipol Üniversitesi
Tıp Fakültesi
Biyokimya Anabilim Dalı, 2014
TKBD-Semen Analizi Kursu
Sunum Planı
Semen analizinde araştırma test prosedürleri
• Reactive oxygen species (ROS)
• Sperm Penetration Assay (SPA)
• DNA Hasarı (Comet Assay)
Genetik testler
• Y-Kromozom Delesyonu
• Fluorescent In situ Hybridization (FISH)
Semende ROS
Bu test semendeki reaktif oksijen radikalleri
(ROS) miktarını belirlemek amacıyla yapılır
 superoxide anion (•O2–)
 hydrogen peroxide (H2O2)
 hydroxyl radical (•OH)
 hypochlorite radical (•OHCI)
ROS luminometre veya spektrofometre ile
değişik parametreler kullanılarak ölçülebilir.
ROS luminometre prosedürü
 Semen numunesi alındıktan hemen sonraki 30
dakika içinde testin yapılması gerekmektedir.
 ROS luminometre kullanılarak relative light
units (RLU) olarak ölçülebilir.
 Fazlaca arttığı durumlarda ROS;sperme direkt
olarak, lipid peroksidasyonu yoluyla ve DNA
hasarı yaratarak zarar verir.
 Ancak fizyolojik koşullarda ROS sperm
kapasitasyonu ve akrozom reaksiyonu için
gereklidir.
Sperm Penetration Assay (SPA)
Bu test ile spermin hamster yumurtasını penetre
etme yeteneğine bakılarak, spermin insan
yumurtasını dölleme potansiyeli ölçülmektedir.
1989’dan beri uygulanmaktadır.
Çalışmalarda SPA test pozitifliği ile IVF başarısı
arasında korelasyon gösterilmiştir.
Ancak testin yanlış negatif sonuçların olması
başarısını azaltmaktadır.
SPA Prosedürü
 Hasta spermi test yolk buffer (TYB) içinde 48
saat bekletilir.
 Dişi hamstırlarda ovulasyon indüksiyonu yapılır.
 Hasta spermleri yıkanır ve swim-up prosedürü
uygulanır (90 dakika 37 C ‘de inkübe edilir).
 Toplanan hamstır yumurtaları hyalüronidaz ile
işleme tabii tutularak kumulustan ayrılır.
Arkasından tripsin ile işleme tabii tutularak zona
uzaklaştırılır.
SPA Prosedürü
Zonası uzaklaştırılan hamstır yumurtaları ve
spermler beraberce 370 inkübe edilir.
Yumurtalar yıkanır ve lam üzerine alınır.
Her bir yumurtayı penetre eden sperm sayısı
kaydedilir.Bu sayı 5’ten büyük ise test normal
kabul edilir.
DNA Hasarı
 Diğer testleri normal olan pek çok sperm
örneğinde DNA hasarı (fragmentasyon)
olabilir.
 İnfertil erkeklerin spermlerinde yüksek
düzeyde DNA hasarı gözlenmektedir1.
 Ayrıca DNA hasarı embriyo bölünmesinde
bozulma2, açıklanamayan infertilite ve
tekrarlayan erken düşük ile ilişkilidir.
1Irvine
DS, et al, 2000; 2Morris ID, et al, 2002
TEST
PRENSİP
TANIMLAMA
YÖNTEMİ
Sperm Chromatin
Structure Assay®
(SCSA) or DNA
Integrity Assay
Susceptibility to
DNA
denaturation
Flow cytometry
Acridine Orange Test (AOT)
Susceptibility to
DNA
denaturation
Single- and
doublestrand
breaks
Fluorescent
microscopy
Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase-mediated
Deoxyuridine
Triphosphate Nick
End Labeling (TUNEL)
In Situ Nick Translation
(ISNT)
Comet assay (neutral and
alkaline)
8-Hydroxydeoxyguanosine
(8-OHdG) Assay
Fluorescent
microscopyBright field
microscopy
Flow cytometry
Single-strand breaks
Single- and double
strand breaks
(double-strand
breaks for neutral)
Measurement of
DNA
oxidation
Detecting 8-OHdG
Single-cell gel
electrophoresis
Fluorescent
microscopy
High performance
Liquid
chromatography
Flow cytometry
AVANTAJ
DEZAVANTAJ
Correlation to other tests Special equipment
Standardized
High sensitivity
Clinically significant
Large number of cells
analyzed
Simple
Indistinct colors
Inexpensive
Poor correlation with other test
Interlaboratory variations
Correlation to other tests Special equipment
Standardized
Interlaboratory variations
High sensitivity
Clinically significant
Specific to endogenous
breaks
High specificity
Quantification of DNA
damage in individual
cell
Quantitative
High specificity
Clinically not proven
Interlaboratory variations
Time consuming Not
standardized
Special equipment
Artifactual oxidation
Comet Assay Test Prosedürü
(Single-cell gel electrophoresis assay)
Sperm agaroz jel ile karıştırılır ve slayt üzerine
yayılır.
Sperm alkali ortamda eritilir ve denatüre edilir.
Slayt elektroforeze tabii tutulur.
Daha sonra etanol ile dehidrate edilir ve Syber
green boyası ile boyanır.
Normal :≤ % 27
Comet Assay
Normal
DNA Hasarı %100
L. Murthy
13
TKBD-Semen Analizi
Kursu
08.04.2015
14
TKBD-Semen Analizi
Kursu
08.04.2015
Genetik Testler
Genetik nedenler erkek infertilitesinde %15
oranında tespit edilmektedir.
Sperm konsantrasyonu <10x106 ise genetik
testler önerilir.
15
TKBD-Semen Analizi
Kursu
08.04.2015
Genetik Testler
Kistik Fibroz Gen mutasyonları (KBVDY)
Yq kromozomu mikrodelesyonları
(Azospermi/ağır oligozospermi)
Kromozom anormallikleri (Klinefelter
sendromu)
Y-Kromozom Delesyonu
Y Kromozom mikrodelesyonlarına azospermik
(8-12%) ve oligospermik erkeklerde (6%),
nadiren de fertil erkeklerde rastlanmaktadır.
Y-Kromozom delesyonu olan ve ICSI düşünen
hastaların, erkek çocukları azospermi açısından
yüksek riske sahiptirler.
17
TKBD-Semen Analizi
Kursu
08.04.2015
Test Prosedürü
• Kullanıma hazır ekstraksiyon kiti(Gentra sistem)
ile DNA elde edilir.
• PCR (multiplex rxn) yapılır.
• PCR ürünleri agaroz jelde yürütülür.
18
TKBD-Semen Analizi
Kursu
B
Primer
08.04.2015
A
Primer
SY143
SRY
SY257
SY134
SMCY
SY255
SY269
E1FAY
SY149
SY243
1
2
1
2
1-Patient with deletions
2-Normal
L.Murthy
19
TKBD-Semen Analizi
Kursu
08.04.2015
AZFa ve AZFb delesyonları
testiküler sperm eldesi
açısından negatif
prognostik değer taşır.
AZFc delesyonu olan
hastalarda %50
oranında testiküler
sperm eldesi şansı
vardır
Fluorescent In situ Hybridization
(FISH)
Bu prosedürde, dekondanse sperm
nükleuslarının yapısını indirekt olarak belirleyen
DNA-spesifik işaretli prob kombinasyonları
kullanılmaktadır.
Sperm kromozom anomalileri
Sex Chromosome disomy
21 disomy
18 disomy
13 disomy
Diploid sperm
FISH Prosedürü
 Spermlar yıkanır ve slayda fikse edilir..
 Sperm baş bölgesinin kompakt kromatin içeriği
dekondanse edilir. Disülfit bağlarını kırmak için
dithiothreithol (DTT) kullanılır.
 DNA prob kitleri kullanılır.
 CEP 18,X,Y probu x,Y ve 18. kromozomda
sentromerik bölgedeki dizileri belirler.
 LSI 13,21 probu 13 ve 21.kromozomdaki dizileri
belirler.
23
TKBD-Semen Analizi
Kursu
Normal
Y,18
Normal
X,18
08.04.2015
24
TKBD-Semen Analizi
Kursu
Abnormal
X,Y,18
Abnormal:
XY18
08.04.2015
25
TKBD-Semen Analizi
Kursu
08.04.2015
Disomy 18:
Disomy 18
XY,18-18
XY,18-18
26
TKBD-Semen Analizi
Kursu
Normal haploid:
13, 21
Normal haploid;
13,21
08.04.2015
27
TKBD-Semen Analizi
Kursu
DisomyDisomy
21:
13, 21-21
08.04.2015
21:
13, 21-21
28
TKBD-Semen Analizi
Kursu
08.04.2015
DDiploid;
13-13, 21-21
Teşekkür ederim…