Transcript Stafilokoku biofilmu veidošanās un tās izpēte

Stafilokoku biofilmu
veidošanās un tās izpēte
Iveta Līduma
20.04.10.
• Klīniskajā praksē strauji pieaug invazīvo procedūru lietošana –
plaši izmanto intravaskulāros katetrus, protēzes un citus
polimēru materiālus.
• Polimērasociētās infekcijas – rada mikroorganismi, kam piemīt
spējas adherēties uz polimēru virsmas.
• Mikroorganismi kolonizē katetrus, mehāniskās sirds vārstules,
endotraheālās caurules un protēzes.
• Mikrorganismi uz polimēra virsmas adherējas un veido
biofilmu.
Biofilma
• Biofilma ir koagregatīva mikroorganismu
populācija, kas veidojas uz kādas virsmas.
Biofilma
• Biofilmas veidošanās sākas no mikroorganismu
migrācijas un piestiprināšanās pie iekārtas
virsmas.
• Kad baktērijas ir piestiprinājušās, tās sāk
dalīties, veido mikrokolonijas un producē
ekstracelulārus polisaharīdus.
• Uz ierīces vai katetra virsmas izveidojas
heterogēna masa.
• Pēdējā biofilmas veidošanās stadijā no biofilmas
sāk atdalīties planktoniskas baktērijas.
Biofilmas veidošanās
Bioplēves veidošanās process var noritēt no dažām stundām līdz vairākām
nedēļām.
• Biofilmā esošajiem
mikroorganismiem samazinās
jutība pret antibakteriālajiem
preparātiem:
mikrovide biofilmā aizsargā
mikroorganismus, neļaujot
preparātam pie tiem piekļūt.
• Starp mikroorganismiem var
notikt apmaiņa ar R-plazmīdu.
• Mikroorganismi ir arī pasargāti no
saimniekorganisma
aizsargspēkiem – fagocītiem,
antivielām.
Biofilmas veidošanās
Images supplied by: DG Allison & IW Sutherland
KONS – biofilmu veidotāji
• Par vienu no galvenajiem virulences
faktoriem tiek uzskatīta spēja veidot
biofilmas.
• Stafilokoki labi adherējas pie dažādām
polimēru virsmām.
• Adherences procesu nosaka gan polimēra
fizikāli ķīmiskās īpašības, gan
mikroorganisma virsmas hidrofobisms un
receptori.
• Otrajā biofilmas attīstības fāzē stafilokoki
izdala ekstracelulārus polimērus.
• Visvairāk pētītais faktors ir PIA.
• PIA produkciju nosaka icaADBC operons.
• Proteīnu dabas adhezīni – Aap (ar
akumulāciju asociētais proteīns)
• Aap proteīnu kodējošais gēns aap biežāk
konstatējams nozokomiālajos izolātos.
• Ica A un aap gēnu klātbūtne tiek
izmantota, lai diferencētu kontaminantus,
kolonizējošos un invazīvos celmus.
Sonikācija
• Lai varētu sekmīgi ārstēt polimērasociētās infekcijas svarīga
ir precīza mikrobioloģiskā diagnostika.
• Sonikācija – apstrāde ar ultraskaņu.
Sonikācija
• Augstas akustiskās
intensitātes parastās
ultraskaņas vannās
nogalina
mikroorganismus.
• Apstrādei ar ultraskaņu
BactoSonic ® ultraskaņas
vannā izmanto zemas
frekvences un zemas
intensitātes ultraskaņu.
• No biofilmas tiek atdalītas
dzīvotspējīgas baktērijas.
Procedūra
• Pēc implantu izņemšanas operāciju zālē tie tiek ievietoti gaisu
necaurlaidīgā traukā un tiek transportēti uz mikrobioloģisko
laboratoriju
• Pievieno Ringera šķīdumu un apstrādā ar vorteksu (30
sekundes).
• Apstrāde ar ultraskaņu – sonikācija (1 minūte), lai varētu
mikroorganismus atbrīvot no biofilmas masas.
• Inokulācija uz agara platēm vai buljonā.
• Kultivē aerobos vai anaerobos apstākļos.
• Sonikācijas šķidrumu var izmantot arī
molekulārbioloģiskajiem izmeklējumiem (PCR), kā arī var
veikt imunoloģiskās analīzes.
www.bactosonic.info
Projekts
Biodrošības kritēriju un metodoloģijas
izstrāde medicīniskās mikrobioloģijas
jomā
Projekta darba grupa:
LU asoc.profesore Dr.biol. T. Tračevska
Mg.biol. I.Līduma
Uģis Bērs
Eiropas Sociālā fonda projekts
“Kapacitātes
stiprināšana
starpnozaru
pētījumos biodrošībā”
Nr.2009/0224/1DP/1.1.1.2.0/09/APIA/VIAA/05
5
Uzdevumi
• Fenotipiski raksturot biofilmu veidošanos,
audzējot KONS in vitro biofilmu stimulējošos
apstākļos.
• Ar molekulārās bioloģijas metodēm noteikt
stafilokoku meticilīna rezistenci, nosakot
mecA gēnu un stafilokoku virulences faktoru
gēnus – aap un icaA.
• Salīdzinātu ica/aap virulences faktorus starp
jutīgiem un rezistentiem celmiem.
• Izvērtēt nozokomiālo celmu mikroorganismu
virulentās īpašības salīdzinājumā ar normālo
floru.
• Tiek izmeklēti veseli cilvēki, kā arī ambulatori
un stacionēti pacienti.
• Paraugi tiek ievākti, pateicoties sadarbībai ar
laboratorijām no vairākām Rīgas un Latvijas
slimnīcām:
TOS, KUS Stradiņi, LIC TPSVK, RAKUS,
Ventspils slimnīca.
Biofilmu veidošanās izpēte
Kultivēšana uz Congo red agāra
Christensen et al. metode – biofilmu veidošanās tiek
novērota krāsojot ar 0,1% kristālvioleto.
Molekulāri bioloģiskās metodes:
icaA un aap, mecA gēnu detektēšana, izmantojot PCR.
biofilmu veidošanas regulētājgēna LuxS ekspresijas analīze
ar
real-time PCR (jaunas metodes aprobācija).
KONS paraugos noteikto aap un icaA
gēnu dominēšana starp invazīvajiem
paraugiem.
18
KONS celmu skaits
16
jutīgie invazīvie celmi
14
rezistentie invazīvie
celmi
jutīgie kontroles
celmi
rezistentie kontroles
celmi
12
10
8
6
4
2
0
aap+/ica+
aap+
ica+
virulences gēni
aap-/ica-
IcaA un aap gēnu salīdzinājums
paraugos no asinīm, intravenozajiem
katetriem un kontroles izolātiem.
12
10
8
6
kontroles paaraugi
asinis
4
2
0
aap/ica+
aap+
ica+
aap/ica-
Sagaidāmie rezultāti
1. Stafilokoku tīrkultūru kolekcija (kriobanka)
2. Klīnisko stafilokoku DNS banka (ap 300-500 paraugiem)
3. Veselo cilvēku stafilokoku RNS un cDNS banka (200
paraugi no veselo cilvēku nasopharynx floras).
4. Izveidota jauna tehnoloģiskā platforma baktēriju virulences
un rezistences marķieru atlasei (četras tehnoloģijas).