Transcript Document

Aleksander Kołodziejczyk
PROTEINY - BIAŁKA
Gdańsk 2011
1
Proteiny = makropeptydy zawierające ponad 100 reszt AA. Nazwę od
proteios (gr.) – pierwszorzędny, najważniejszy wprowadził w 1883 r. J.
J. Bercelius.
Masa cząsteczkowa protein przekracza 10 kDa (>15 kDa); średnia MM
reszty statystycznego AA występującego w białku wynosi ~100
(dokładnie 110). MM reszty Gly = 57; reszt 8 AA poniżej 100, 6 ~ 100,
9 > 100. W cząsteczce białka może znajdować się 100, kilkaset, a nawet
więcej reszt AA.
W skład białek wchodzą głównie AA kodowane, których jest 20 (22).
Ponadto występują w nich inne, tzw. AA białkowe; jest ich kilkadziesiąt.
Zróżnicowanie B. pod względem ich składu i wielkości cząsteczek
stwarza ogromną możliwość kombinacji, np. liczba białek zawierających
w łańcuchu 150 reszt tylko kodowanych AA osiąga wartość 20150.
Liczba ta odpowiednio wzrasta z uwagi na fakt, że w skład białek
wchodzą również AA inne niż kodowane.
Należy również wziąć pod uwagę różnorodną wielkość łańcucha
białkowego: 20100 + 20101 + 20102 + 20103 + 20104 + 20105 + ......
2
Praktycznie liczba białek jest ograniczona do tych, które pełnią jakąś
funkcję, czyli do białek potrzebnych. W komórce E. coli jest ich ~ 3
000; dawniej u ludzi szacowano ich liczbę na 100 000, ale po rozszyfrowaniu ludzkiego genomu okazało się, że jest ich „tylko” ~ 23 000.
Białka stanowią:
80-90% ogółu
zw. organicznych
organizmów żywych
50% suchej masy
dorosłego człowieka
75% suchej masy
tkanek miękkich
dorosłego człowieka
Białka pełnią funkcję:budulcową, motoryczną, katalityczną,
transportową, substancji zapasowej, podstawowego składnika
pożywienia (obok cukrów i tłuszczów).
Połowa masy białek w organizmie człowieka odnawia się średnio w
przeciągu 80 dni. B. wątroby i osocza krwi odnawiają się co 10 dni, a
mięśni co kilka miesięcy.
3
Podział białek, wg
A. kształtu:
- globularne lub sferyczne, inaczej kłębuszkowe, korpuskularne
(albuminy, globuliny, gluteiny i inne)
- firylarne - włókienkowate
rozpuszczalne (fibrynogen, miozyna)
nierozpuszczalne - skleroproteiny (kolagen, keratyna, fibroina)
B. składu:
- proste, inaczej proteiny lub homoproteiny są zbudowane wyłącznie
reszt aminokwasów (kolagen, keratyna, albuminy, gluteiny,
miozyna i inne).
- złożone, inaczej proteidy zawierają oprócz reszt AA inne elementy, np.
chromoproteiny, fosforoproteiny, glikoproteiny, lipoproteiny
czy metaloproteiny.
4
C. funkcji:
- zapasowe (prolaminy, białka jaj);
- szkieletowe (skleroproteiny);
- ciała czynne (enzymy, hormony, przeciwciała);
- receptory (receptory opioidowe, rodopsyna);
- wykonujące prace mechaniczną (b. mięśni);
- kontrolujące przepływ materii i energii(b. represorowe, czynniki
wzrostu, hormon tyreotropowy);
- transportowe (transferyna, hemoglobina);
- ochronne (przeciwciała).
D. pochodzenia:
- roślinne (prolaminy, gluteiny);
- zwierzęce (b. mleka, b. krwi, b. mięśni);
- drobnoustrojowe (b. drożdży, b. bakteryjne, b. wirusów).
E. występowania: białka mięśni, mleka, jaj, osocza, komórkowe,
rybosomalne, oka, krwi i inne.
5
F. wartości odżywczej:
- pełnowartościowe – zawierają wszystkie AA niezbędne w potrzebnych
ilościach (np. b. mięśni, jaj, ryb);
- częściowo pełnowartościowe
wystarczają do podtrzymywania życia, nie zapewniają
prawidłowego rozwoju (np. b. roślinne – niedobór Lys);
- niepełnowartościowe
przyswajalne, ale niewystarczające do podtrzymywania życia, ale
nie zawierają jednego lub więcej AA niezbędnych, np. w żelatynie
brakuje Trp i Cys (niedobór Met, Ile, Val i Tyr);
- bezwartościowe nieprzyswajalne (np. b. włosów, paznokci czy rogów).
6
Strukturalna budowa białek
I. Struktura pierwszorzędowa – skład i sekwencja:
np. Phe-Val-Ala-Leu-Asn-.................
II. Struktura drugorzędowa – kształt i forma łańcucha białkowego.
III. Struktura trzeciorzędowa – kształt cząsteczki białka wynikający z
wzajemnego oddziaływania grup funkcyjnych: -COO-....H3N+-; -S-S-;
wiązań wodorowych i innych.
IV. Struktura czwartorzędowa – dwie lub więcej cząsteczek
białkowych (globin) tworzą agregaty bez wiązań kowalencyjnych.
7
Struktura pierwszorzędowa – skład i sekwencja
Właściwości fizykochemiczne, chemiczne i biologiczne białek są
determinowane składem i sekwencją AA. Podmiana jednego AA w
określonym białku może spowodować dramatyczną zmianę jego
właściwości. Bywa jednak i tak, że białka różniące składem AA
w 20 a nawet 30% pełnią podobną funkcję biologiczną.
Skład aminokwasowy wybranych białek
Reszta
AA
Liczba reszt poszczególnych AA w cząsteczce białka
lizozym
drobiowy
cytochrom c H
ferredoksyna
lipotropina b
owcza
insulina
wołowa
Hemoglobina
bH
Średnia
zawartość w
statystycznym
białku [%]
Ala
Gly
12
12
6
13
9
6
13
8
3
4
21
7
9,0
8,7
Ile
6
8
4
1
1
0
4,6
Met
Trp
2
6
3
1
0
1
2
1
0
0
2
0
1,7
1,1
8
Oznaczanie składu AA białek
6N HCl
białko
110oC, 24h
AA1 + AA2 + AA3 + AA4 + ..... miesza-
nina AA
HPLC
AA1 AA2 AA3 AA4 .....
rozdzielone i
oznaczone AA
Większość AA białkowych
nie ma chromoforu, dlatego
w celu detekcji przeprowadza
się je w barwne pochodne,
często za pomocą
ninhydryny.
Chromatogram rozdzielonych aminokwasów kodowanych
O
O
O
O
+ HOH
OH
- HOH
OH
ninhydryna
O
Do wykrywania barwnych pochodnych
wykorzystywane są detektory UV/Vis. 9
Pochodne AA powstające w reakcji z aldehydem o-ftalowym lub
chlorkiem dansylu wykrywane są za pomocą znacznie czulszych
detektorów fluorescencyjnych.
N(CH3)2
CHO
aldehyd
CHO o-ftalowy
chlorek
dansylu
SO2Cl
Oznaczanie N-terminalnego AA
Val-Gly-Lys-Ala
DNP-F
+
DNP- Val-Gly-Lys-Ala H /HOH
F
O2N
DNP
(CH3)2-CH-CH-COOH
NH
NO2
2,4-dinitrofluorobenzen, DNP-F
DNP- Val + Gly + Phe + Lys + Ala
O2N
NO2
DNP-Val
N-terminalny AA można też oznaczyć za pomocą aminopeptydazy,
czyli enzymu hydrolizującego białka (peptydy) od N-końca.
10
Oznaczanie C-terminalnego AA
AA1-.......-AAn-1-AAn
1. NH2NH2
2. H+/HOH
AA1-NHNH2 + AAn-1-NHNH2 + AAn
hydrazydy
wolny
aminokwas
C-terminalny AA można również za pomocą karboksypetydaz, czyli
enzymów hydrolizujących białka (peptydy) od C-końca.
11
Oznaczanie sekwencji AA w białku
Sekwencję AA oznacza się często za pomocą degradacji Edmana.
N-terminalny AA białka (peptydu) pod wpływem fenyloizotiocyjanianu
zostaje odszczepiony i przekształcony w pochodne 3-fenylo-2tiohydantoiny (PTH)
H O
H O
N C S + H2N C C NH C C NH .........
R
R'
fenylotioizocyjanian
reszta AA
N-terminalnego
S
H O
NH + H N C C NH .........
2
CHR
R'
reszta kolejnego
O
AA N-terminalnego
pochodna 3-fenylo-2-tiohydantoiny (PTH)
N
12
Za pomocą zwykłej degradacji Edmana można oznaczyć sekwencję do
10 kolejnych AA od N-końca; na skutek niepełnego odszczepienia Nterminalnego AA i równoczesnego odszczepienia drugiego z kolei AA
wzrasta stężenie zanieczyszczeń, co utrudnia analizę.
Dłuższe peptydy, a tym bardziej białka należy poddać niepełnej
hydrolizie i przeprowadzić analizę sekwencyjną otrzymanych
fragmentów peptydowych, po czym poskładać fragmentaryczne
dane w całość podobnie jak układankę.
Dużym ułatwieniem jest hydroliza białek (peptydów) za pomocą
enzymów, które tną łańcuch peptydowy w określonych miejscach.
13
Enzymy specyficznie hydrolizujące wiązania peptydowe
Enzym
Trypsyna (T)
AA, którego wiązanie jest
hydrolizowane
Miejsce
hydrolizy
Lys, Arg (AA zasadowe)
AA-
Chymotrypsyna (CT)
Tyr, Phe, Trp (aromatyczne)
Pepsyna (P)
Tyr, Phe, Trp (aromatyczne)
NHCHAANHCH-CO-
NHAA
Termolizyna (TL)
Ile, Leu, Val (duże alifatyczne)
-CO-
NHAA
Klostrypaina
Proteaza ze Staphylococ.
Arg
Arg-
Asp
NHCHAspNHCH14
Sekwencja AA b-MSH
1
3
2
5
4
7
6
9
8
11
10
14
13
12
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly
T
1
2
3
5
4
7
6
9
8
10
11
12
13
14
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg + Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly
1
2
3
4
5
6
7
9
8
10
11
12
13
14
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly
CT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe + Arg-Trp + Gly-Lys-Pro-Val-Gly
15
Analizę sekwencyjną AA białek usprawniło zastosowanie automatycznych sekwentatorów, ich działanie jest też oparte na degradacji
Edmana, ale reakcję prowadzi się na fazie stałej, w sposób podobny do
syntezy peptydów metodą SPPS.
Degradacja na fazie stałej pozwala na dokładnie wymycie wszystkich
reagentów i produktów, dzięki czemu unika się gromadzenia
zanieczyszczeń i reagentów, tak że kolejny etap degradacji daje wynik
równie pewny jak poprzedni. Za pomocą automatycznego
sekwentatora można określić sekwencję 100 kolejnych reszt AA.
Enzymatyczna analiza sekwencyjna białek
Zachowując ostrożność można za pomocą leucyloaminopeptydazy,
kolejno odszczepiać AA od N-końca peptydu lub białka. Karbopeptydaza A hydrolizuje większość AA C-terminalnych za wyjątkiem Lys, Arg,
His i Pro, które z kolei są hydrolizowane przez karbopeptydazę B.
Za pomocą mieszaniny tych enzymów można kolejno odszczepiać AA
od C-końca; ich hydroliza biegnie jednak z różną szybkością, dlatego
16
trudno opracować standardowe warunki.
Oznaczanie sekwencji AA za pomocą spektrometru mas
Stosując odpowiednią jonizację peptydu można odszczepiać jego
fragmenty w sposób umożliwiający ustalenie sekwencji AA.
Wykorzystanie sekwencji genu odpowiedzialnego za biosyntezę
białka do ustalenia sekwencji tego białka
Sekwencja nukleotydów we fragmentach DNA (genach) jest łatwiejsza
do ustalenia niż sekwencja AA w białkach.
Sekwencja białka ustalona na podstawie budowy genu kodującego to
białko odpowiada łańcuchowi makropeptydu utworzonego na
rybosomach. W składzie AA białka rzeczywistego należy uwzględnić
postrybosomalne modyfikacje.
17
Struktura drugorzędowa białek – kształt i forma łańcucha białkowego
O kształcie łańcucha peptydowego decyduje sekwencja AA i warunki
zewnętrzne.
wiązanie częściowo
Płaskie wiązanie peptydowe -CO-NH- jest
częściowo usztywnione i zwykle przyjmuje
ułożenie trans, rzadziej cis. Wokół innych
wiązań zapewniony jest swobodny obrót.
O
-C-CO-
C
C
usztywnione
O ..
C
OH
C
N
sp3
H
N sp2
..
C C
-NC-
N
C
Wiązanie peptydowe w białkach najczęściej występuje w formie trans.
O
C
trans
N
H
C
O
C
N
C
O
H
C
cis
cis
N
C
Pro
Reszta Pro preferuje formę cis i zwykle tam gdzie się ona znajduje
18
dochodzi do zwrotu kierunku łańcucha peptydowego.
Łańcuch peptydowy, dzięki swobodnemu obrotu wokół większości
wiązań charakteryzuje się dużą swobodą konformacyjną – może
przyjmować różnorodne kształty.
W rzeczywistości, zahamowanie obrotu wokół wiązania CO-NH-,
właściwości reszt AA tworzących łańcuch peptydowy oraz wpływ
środowiska ograniczają możliwości konformacyjne białek do pewnych
form.
Do najważniejszych, konformacyjnych form łańcuchów peptydowych
należą struktury: helikalne (helisy), harmonijkowe (pofałdowanej
kartki), zwroty (zgięcia), ,b czy g, kolagenowe i inne tzw.
nieuporządkowane.
Struktury helikalne - helisy
Określone sekwencje AA wykazują tendencję do formowania łańcucha
peptydowego w kształt śruby. Struktury takie nazywane są helisami;
mogą mieć różne parametry i różne symbole, np. -helisa; znane są inne
helisy.
19
Kształt śruby jest utrzymywany dzięki wiązaniom wodorowym -NH.....O=C- pomiędzy grupami -NH i OC-, oddalonych od siebie wiązań
peptydowych. W -helisie wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy
grupą -CO i grupą HN- czwartego z kolei aminokwasu
w łańcuchu peptydowym.
1
O
R
n+1 2
H
3
O
R
n+3
4
H
O
R
n+5
O H
N CH C N CH C N CH C N CH C N CH C N CH C N
n
H
H R
O
Rn+2
H
Rn+4
H
O
1
2
3
4
h: skok zwoju
d: część zwoju 1 AA
n: liczba AA/zwój
Helisa  jest przedstawiana również symbolem (3,613), gdzie 3,6
oznacza liczbę AA tworzących jeden zwój. Liczba 13 mówi ile atomów
20
znajduje się w pierścieniu połączonym wiązaniem wodorowym.
Do AA wykazujących tendencje do tworzenia układów helikalnych
należą: Met, Glu, Leu, Ala, Gln, Lys, His i Cys. Aminokwasy
destabilizujące strukturę helikalną to : Pro, Gly, Ile, Val, Leu, Tyr,
Asn, Ser i Thr. Strukturę helikalną w białkach wykrywa się
technikami chiralooptycznymi lub laserową spektroskopią Ramana.
Struktura harmonijkowa b (pofałdowanej kartki)
Tworzy się pomiędzy dwoma, równolegle ułożonymi fragmentami
łańcucha peptydowego; znane są dwa typy tej struktury I i II.
O C
R N H
HC
C O
H N R
CH
O C
O C
R N H
HC
C O
H N R
CH
O C
N H
N H
I
równoległa
Struktury harmonijkowe
N H
O C R
CH
H N
R C O
HC
N H
O C R
CH
O C
R N H
HC
C O
H N R
CH
O C
N H
II
antyrównoległa
21
Wiązanie peptydowe w sekwencji -AA-Pro- ma tendencję do
przyjmowania formy geometrycznej cis.
O
C
N
C
C
H
trans
O
O
N
C
H
C
cis
cis
N
C
Pro
Zwrot b, (b-zgięcie, b-turn)
Zwane również zgięciem spinki do włosów. Charakterystyczny element
strukturalny, który zmienia kierunek łańcucha peptydowego o 180o.
R
R
N
n+2
R
C
CH
CH
O C
O
CH C
n+1
R
N HC
H
n+3
O
NH
N
C
H
H
N
O
Rn
CH
C
Bardzo często w b-zgięciu znajduje się Pro; jest
to AA bez funkcji -NH-, wobec czego w tym
miejscu układ helikalny zostaje przerwany.
Najczęściej spotykanymi AA w b-zwrocie są
Pro, Gly, Asp, Ser i Asn.
O
22
60% łańcuchów stastycznego białka przyjmuje konformację -helisy
lub b-harmonijki, kolejne miejsce zajmuje b-zwrot. Inną ważną
struktura białka jest struktura kolagenowa.
Kolagen
należy do najpopularniejszych b. ssaków – główny składnik skóry,
chrząstek, znacznej części mięśni, kości, ścięgien i zębów.
Podstawową jednostką kolagenu jest superhelisa złożona z trzech
polipeptydowych lewoskrętnych helis – różnych od -helisy. Jednostka
ta nosi nazwę tropokolagenu, a jej długość dochodzi do 300 nm.
23
Wyróżnia się również struktury naddrugorzędowe.
Zalicza się do nich:pęczki 4 helis, układ bb
(b-harmonijka--helisa-b-harmonijka),
układ 8 fragmentów b otoczonych 8 helisami i inne.
Struktura trzeciorzędowa wynika z działania sił przyciągających, np.
jonowych, wodorowych czy typu van der Walsa.
AAn-AAm-AAm+n
H 3N
+
- C
O
O
AAn-Cys-AAm-Cys-AAm+n+2
S S
oddziaływania jonowe wiązania disulfidowe
CH3
CH
H3C CH3
CH3
H3C
wiązania wodorowe
NH
O
H
O C
CHR
CH3
CH
oddziaływania hydrofobowe
24
Struktury trzeciorzędowe są odpowiedzialne za kształtowanie białek
globularnych
25
Struktura czwartorzędowa
Opisuje agregaty złożone z dwóch lub więcej
pojedynczych łańcuchów makropeptydowych, tzw.
podjednostek. Podjednostki mogą być identyczne
(b. homogeniczne) lub różne (b. heterogeniczne).
białka homogeniczne
laktoglobulina składa się z 2 podjednostek;
katalaza wątroby wołu – 4;
dehydrogenaza alkoholowa – 4,
aminopeptydaza z cytozylu – 6,
syntaza glutaminowa z mózgu świni – 8.
białka heterogeniczne
hemoglobina – 4,
dehydrogenaza jabłczanowa – 4,
kinaza asparaginowa – 4,
wirus mozaiki tytoniowej – 2130.
26
Denaturacja białek
Właściwości biologiczne białek zależą od ich konformacji. Zmiana
konformacji natywnej na inną powoduje zwykle całkowitą utratę
aktywności biologicznej białka. Zmiana właściwości białka w wyniku
przekształcenia jego konformacji nosi nazwę denaturacji białka.
Denaturacja jest spowodowana przemianami w obrębie II, III i IV
rzędowej struktury białka, nie dochodzi do rozrywania wiązań
kowalencyjnych, tzn. zachowana zostaje struktura I rzędowa. Zmiany
struktury I rzędowej związane są z degradacją białka, tj. z hydrolizą
wiązań peptydowych.
W trakcie denaturacji zachodzą następujące procesy:
rozpad agregatów;
niszczenie wiązań wodorowych i jonowych;
deformacja układów helikalnych, struktur b i innych struktur.
Denaturację powodują: podwyższona lub obniżona temperatura;
rozpuszczalniki organiczne; detergenty; reduktory; promieniowanie
twarde (X, UV, g); elektrolity lub substancje tworzące silne wiązania
27
wodorowe (np. mocznik, guanidyna).
Denaturacja może być odwracalna lub nieodwracalna. Przykładem
denaturacji nieodwracalnej jest gotowanie jajka; ugotowane jajko nie
można przekształcić w jako surowe. Przykładem denaturacji
odwracalnej jest rozpuszczanie i żelowanie żelatyny.
Bardzo poglądowa jest denaturacja rybonukleazy, enzymu
hydrolizującego kwasy rybonukleinowe. W łańcuchu rybonukleazy
zawierającym 124 reszty AA znajdują się 4 mostki disulfitowe
utworzone przez 8 reszt Cys.
10
1
Mostki te są odpowiedzialne za utrzymanie
aktywnej konformacji rybonukleazy.
30
26
S
20
72
80
S
84
40
S
110
95 124
S
S
S
58
50
28
S
S
65
10
10
1
26
30
20
S
1
72
80
S
84
40
110
95 124
S
20
26
HS
65
50
HS
58
84
50
HS
rybonukleaza natywna
(aktywna)
SH
58 SH
40
b-sulfanyloetanol
65
S
S
S
mocznik i
S
S
30
95
rybonukleaza
zdenaturowana
(nieaktywna)
72
HS
80
110
HS
SH
124
Utlenianie zdenaturowanej rybonukleazy tlenem z powietrza w
warunkach zbliżonych do fizjologicznych (w wodzie, pH~7), bez
reduktorów i czynników denaturujących odtwarza rybonukleazę
o pierwotnych właściwościach.
10
1
30
20
26
HS
50
65
HS
84
HS
95
HS
10
1
30
26
S
72
HS
80
110
SH
124
dializa usuwająca
mocznik i
b-sulfanyloetanol
SH
58 SH
40
1
utlenianie grup -SH
2
20
72
80
S
84
40
S
110
95 124
S
S
O2
S
58
50
S
S
65
29
Utlenianie zdenaturowanej rybonukleazy w środowisku różnym od
fizjologicznego, w obecności czynników denaturujących daje produkt
wykazujący 1% aktywności. 1% - tyle mniej więcej wynosi
prawdopodobieństwo przyjęcia natywnej konformacji.
Dla większości białek takie prawdopodobieństwo
jest znacznie mniejsze. Podczas tworzenia się
białka pożądaną konformację wymuszają
wówczas specjalne enzymy. Podobny problem był
podczas łączenia dwóch łańcuchów insuliny.
10
1
30
20
26
HS
50
65
HS
84
HS
SH
58 SH
40
95
HS
72
HS
80
1
Gly
110
Ile
SH
2
16 17
15
3
Val
124
Glu
14 Gln
13 Tyr
4
Gln
5
11
S S
7
Phe
1
Val
2
S
S
Asn
3
7
Ile
Cys
18
10
20
Glu
21
22 Arg
16 Tyr
10
Leu
Leu
Val
Thr
30
Pro
29
B
Phe 24
Tyr
12
Thr
Asn
Phe 25
13
Lys
21
23 Gly
15
14
Glu
Cys
Gly
Val
Ala
S
S
A
Cys
17 Leu
11
insulina
19
9
Cys Gly
4
Gln
Leu
8 Ser
His
6
9 His
5
20
Ser
Thr Ser
8
Asn 19
Tyr
12 Leu
Cys
6 Cys
18
Leu Glu
26
27
28
30
Denaturacja białek podczas obróbki termicznej produktów żywnościowych ma korzystne działanie. Następuje wówczas rozluźnienie i
rozwinięcie łańcuchów polipeptydowych, co znacznie ułatwia
trawienie. Nie bez znaczenia jest też dezaktywacja niektórych
niepożądanych w pożywieniu enzymów, np. proteaz czy lipaz.
Długotrwałe ogrzewanie potraw ma jednak działanie niekorzystne,
powoduje rozkład niektórych AA, prowadzi do ich racemizacji
oraz zwiększa usieciowanie łańcuchów polipetydowych.
31