Transcript 乳酸对LPS诱导的RIMMVECs细胞信号通路NF

嗜酸乳杆菌代谢产物乳酸对体外培养
乳酸对LPS诱导的RIMMVECs细胞信
MIMVECsLPS模型信号通路调控作用的研究
号通路NF-κB的调控作用
北京农学院 任晓明
[email protected]
研究背景和目的
 乳酸菌
乳酸菌是目前应用最广且效果最好的一类益生菌，
但其保健抗病的作用机制还不十分明了。
 乳酸菌代谢产物乳酸的抗病作用
我实验室前期研究表明，乳酸对大肠杆菌和沙门氏
杆菌的腹泻模型具有很好的抗病作用，对大肠杆菌
内毒素（LPS）所致的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞
（RIMMVECs）损伤有明显的修复和抗损伤作用 。
研究背景和目的
微血管内皮细胞（MVECs）在炎症反
应中的作用
很多研究已经证明，在未受到损伤因子
攻击情况下，MVECs分泌少量的白细胞介
素（IL-1和IL-6）。当受到内毒素（LPS）
、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子攻击的
时候IL-1、IL-6的表达量大幅上调，参与炎
症反应和炎性损伤过程。
研究背景和目的
 LPS对MVECs的损伤作用
致病性大肠杆菌（EPEC）能引起仔猪腹
泻等多种疾病，主要是通过其产生的毒素（
LPS）发挥致病作用。近年来国内外对LPS
的研究较多，很多集中在LPS所介导的细胞
信号转导通路的调控上。 LPS能激活靶细胞
信号转导通路表达炎性因子，导致一系列炎
性反应，是EPEC致病性的的重要机制。
研究背景和目的
 LPS对MVECs细胞信号转导通路NK-κB的
激活及其作用
LPS攻击MVECs后，激活NK-κB信号通路
产生IL-6、TNF-α、NO和表达黏附因子，这
些变化在局部组织损伤和修复、弥散性血管
内凝血（DIC）、脓毒血症和多器官功能衰竭
的发生过程中发挥重要作用。
研究背景和目的
LPS诱导MVECs产生IL-6和TNF-α。如果
能抑制这些因子的合成，便可下调NF-κB细胞
信号转导通路的激活程度，进而抑制炎性反
应。为深入探讨益生菌代谢产物抑制LPS激活
NF-κB细胞信号转导通路的调控作用，本实验
测定了不同条件下NF-κB p65亚基的mRNA和
蛋白的表达情况。从基因和蛋白表达两个层
面，探讨乳酸菌代谢产物调控靶细胞抗损伤
的细胞信号转导通路的某些机制。
材料与方法
细胞分组
试验
空白对照组
 LPS（阳性）对照组
 乳酸高浓度预处理组
ELISA
RealTime-PCR
乳酸中浓度预处理组
乳酸低浓度预处理组
WesternBlot
RIMMVECs的分离、培养
与鉴定
RIMMVECs分离自10日龄内乳鼠肠粘膜
，至细胞生长到80%呈融合状态时进行
传代培养，对传至第6代的细胞进行鉴定
。方法是采取SP免疫细胞化学法进行内
皮细胞第Ⅷ因子相关抗原（F-ⅧRag）的
鉴定。
荧光定量PCR


将RNA反转录为cDNA，按照以下反应体系进行：模板
（RNA）3μg；引物（50μM）T18,4.0μl；DEPC处理
水至25μl，混匀，70℃5min，立即冰浴；5×buffer，
8.0μl；dNTP（10mM）,4.0μl;RNase Inhibitor,1.0μl,
混匀，37℃5min；M-MuLV，2.0μl，42℃60min，
70℃10min。
定量PCR检测按照以下反应体系进行：模板（cDNA）
/ddH2O,1.0μl;10μM引物F/R，0.5μl;2×PCR Mix，
12.5μl；Eva green；1μl；ddH2O,10μl，混匀，置于
荧光定量PCR仪中。
制备RNA

RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两
条明亮条带，无DNA条带污染。
荧光定量PCR

通过PCR验证筛选出各基因的引物PCR如下图
M
1
2
3
4
M
M：DL2000 DNA ladder 1：β-actin 2：NF-kB 3
：β-actin空白对照 4：NF-kB空白对照
引物名称及序列
检测基因表达水平
用RT-PCR方法检测IκB的基因表达水平
。设计引物，提取细胞总RNA加入反应体系
中，进行逆转录以及PCR扩增cDNA。然后
进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射灯下观察
，最后对凝胶条带进行灰度扫描，将灰度值
进行统计学处理。
内参基因引物检出限

内参actin基因的引物检出限
----1.56×10 (7)
----1.56×10 (6)
----1.56×10 (5)
----1.56×10 (4)
----1.56×10 (3)
----1.56×10 (2)
----1.56×10 (1)
----空白对照
检测蛋白表达水平
用Western blot方法检测IκB的蛋白表达水平
。LPS攻击细胞，用裂解缓冲液裂解细胞，经
SDS-PAGE凝胶电泳分离后，将凝胶上的蛋
白质转移至硝酸纤维素膜上。加入兔IκB多克
隆抗体，加入HRP标记的羊抗兔IgG，DAB显
色，用凝胶分析软件对显色条带进行半定量
分析，面积与荧光强度的乘积代表IκB蛋白表
达的相对量。
NF-kB基因引物检出限

NF-kB基因的引物检出限
----1.22×10
(7)
----1.22×10
(6)
----1.22×10
(5)
----1.22×10
(4)
----1.22×10
(3)
----1.22×10
(2)
----1.22×10
(1)
----空白对照
内参actin基因的标准曲线
内参actin基因的标准曲线
Threshold cycle
35
y = -3.4743x + 35.306
2
R = 0.9986
30
25
20
15
10
5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
6.5
log(initial copy number of template DNA)
7.5
NF-kB基因的标准曲线
NF-kB基因的标准曲线
35
y = -3.5661x + 32.651
2
R = 0.9984
Threshold cycle
30
25
20
15
10
5
0
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
log(initial copy number of template DNA)
6.5
7.5
数据处理

实时荧光定量PCR：目的基因的相对表达量
用ΔΔCt法计算，ΔCt（目的基因）=Ct（目的
基因）－Ct（内参基因），ΔΔCt=ΔCt（处理
组）－ΔCt（空白组）。目的基因的相对表达
量=2-ΔΔCt ，数据用spass11.5进行统计分析
，荧光实时定量PCR结果使用均值±标准误
表示，其中各基因的表达量所示结果均经过
内参β-actin表达量进行校正。
数据处理

Western Blotting:检查PVDF膜上的预染Marker在膜
上的对应位置及电泳起始点，确定目标条带后用
Gel-ProAnalyzer6.0软件测定目标条带面积和灰度
值，将NF-κB p65和β-actin对比做半定量分析。
蛋白含量=条带面积×平均灰度；蛋白半定量值=
NF-κB p65蛋白含量/β-actin蛋白含量。数据采用均
值±标准误表示，统计分析应用SPSS11.5统计软件
，多组间比较采用单因素方差分析。显著性差异水
平为P＜0.05，极显著性差异水平为P＜0.01。
结 果
细胞鉴定
ELISA
RT-PCR
WesternBlot
RIMMVECs的培养
RIMMVECs的鉴定
ELISA检测结果
ELISA检测结果
RT-PCR扩增曲线

NF-κB p65亚基基因的扩增曲线
RT-PCR扩增曲线

内参β-actin的扩增曲线
RT-PCR熔解曲线

NF-κBp65亚基的熔解曲线
RT-PCR熔解曲线

β-actin的熔解曲线
RT-PCR试验结果

NF-κB基因在不同处理组中的实时荧光定量
PCR结果
Western Blotting结果
NF-κB p65的蛋白Western Blotting
 β-actin


NF-κB p65
Western Blotting结果
Western Blotting结果
结
论
乳酸对LPS激活RIMMVEC的NF-κB细胞信
号转导通路具有明显的抑制作用，下调了转
录因子NF-κB的转录活性，进而抑制了炎性因
子TNF-α和IL-6的表达。
请各位批评指正！
谢谢！