实验六 酶促反应中的竞争性抑制 《食品生物化学实验 》课程 一、实验目的 1、掌握琥珀酸脱氢酶的提取方法 2、学习离心机和高速组织捣碎机的使用 3、观察竞争性抑制剂和底物浓度对酶促反应速率的影响 二、实验原理 琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸，脱下的 氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下，还原态 的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝，从而引起非常明显 的颜色变化反应，接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性 越高，甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢， 可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙 二酸存在时，琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。 由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色， 所以本实验用石蜡油封闭反应液，制造无氧的环境。 三、实验步骤 1、琥珀酸脱氢酶的提取 取新鲜猪心一个（100g），切碎，加 100ml的1/15 mol•L-1 Na2HPO4，放入组织捣碎机 中捣烂成浆。然后在高速离心机上用12000 rpm离 心15min，0-4℃ ，取上清液即为琥珀酸脱氢酶提 取液。（各组共用） 2、竞争性抑制观察 取四支指形管，按下表依次加入各种液体 （CK指形管中的酶液要事先煮沸10min），在指形 管中加入酶液后，迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀， 立即加入石蜡油封闭液体（加入石蜡油封闭液体 后千万不可震动），以隔绝空气。于室温下静止 观察变色情况。 管号 CK 1%琥珀酸（滴） 5%琥珀酸（滴） 1%丙二酸（滴） 水 （滴） 酶液 （滴） 8煮沸 根据酶活力情况调整 10min （20 ） （20 ） （20 ） 滴数 （20 ） 甲烯蓝 （滴） 石蜡油 （滴）
实验六 酶促反应中的竞争性抑制 《食品生物化学实验 》课程 一、实验目的 1、掌握琥珀酸脱氢酶的提取方法 2、学习离心机和高速组织捣碎机的使用 3、观察竞争性抑制剂和底物浓度对酶促反应速率的影响 二、实验原理 琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸，脱下的 氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下，还原态 的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝，从而引起非常明显 的颜色变化反应，接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性 越高，甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢， 可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙 二酸存在时，琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。 由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色， 所以本实验用石蜡油封闭反应液，制造无氧的环境。 三、实验步骤 1、琥珀酸脱氢酶的提取 取新鲜猪心一个（100g），切碎，加 100ml的1/15 mol•L-1 Na2HPO4，放入组织捣碎机 中捣烂成浆。然后在高速离心机上用12000 rpm离 心15min，0-4℃ ，取上清液即为琥珀酸脱氢酶提 取液。（各组共用） 2、竞争性抑制观察 取四支指形管，按下表依次加入各种液体 （CK指形管中的酶液要事先煮沸10min），在指形 管中加入酶液后，迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀， 立即加入石蜡油封闭液体（加入石蜡油封闭液体 后千万不可震动），以隔绝空气。于室温下静止 观察变色情况。 管号 CK 1%琥珀酸（滴） 5%琥珀酸（滴） 1%丙二酸（滴） 水 （滴） 酶液 （滴） 8煮沸 根据酶活力情况调整 10min （20 ） （20 ） （20 ） 滴数 （20 ） 甲烯蓝 （滴） 石蜡油 （滴）
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