Transcript Ασκηση 7-Απομόνωση Νουκλεικών οξέων

Ε.Κ.Φ.Ε. Ευβοίας – Αποµόνωση νουκλεικών οξέων
ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ
Στόχοι
Υπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα για τα πειράµατα αποµόνωσης DNA. Σ’ αυτά
υπάρχουν διαφορές όπως το είδος του ιστού που χρησιµοποιείται για την
αποµόνωση: φυτικός (τοµάτα, κρεµµύδι, µπανάνα) ή ζωικός (επιθηλιακά
κύτταρα από τη στοµατική µας κοιλότητα) Σε κάθε περίπτωση απαιτείται να
κατανοήσουµε σαφώς το πού βρίσκεται το DNA, τη δοµή του µορίου του, µε
ποιες τεχνικές και µε ποια υλικά επιδιώκουµε την αποµόνωσή του, έτσι ώστε
το πείραµα να είναι διδακτικά χρήσιµο για τους µαθητές.
Στοιχεία Θεωρίας
Τα φυτικά κύτταρα που θα χρησιµοποιηθούν για την αποµόνωση των
νουκλεικών οξέων είναι ευκαρυωτικά κύτταρα. Όπως όλα τα κύτταρα
περιβάλλονται από πλασµατική µεµβράνη (απλή στοιχειώδης µεµβράνη).
Χαρακτηριστικό των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι η ύπαρξη οργανωµένου
πυρήνα µέσα στον οποίο φυλάσσεται το γενετικό υλικό. Ο πυρήνας
περιβάλλεται από δύο στοιχειώδης µεµβράνες.
∆οµή της πλασµατικής µεµβράνης (απλή στοιχειώδης µεµβράνη).
Σύµφωνα µε το µοντέλο του «ρευστού µωσαϊκού» οι µεµβράνες αποτελούνται
από µία διπλοστιβάδα φωσφολιπιδίων ανάµεσα στα οποία παρεµβάλλονται
στεροειδή (όπως χοληστερόλη) και πρωτεΐνες. Στη διπλοστιβάδα των
φωσφολιπιδίων τα υδρόφιλα τµήµατα τους στρέφονται προς το εξωκυτταρικό
και ενδοκυτταρικό περιβάλλον, που είναι υδατικά. Αντίθετα τα υδρόφοβα
τµήµατα, δηλαδή οι ουρές των φωσφολιπιδίων, στρέφονται προς το
εσωτερικό της κατασκευής, ώστε να αποφεύγουν την επαφή τους µε το νερό.
Οι έλξεις που αναπτύσσονται µεταξύ των υδρόφιλων τµηµάτων και των
µορίων του νερού, καθώς και οι έλξεις των υδρόφοβων τµηµάτων µεταξύ
Αταµπασίδη Ελένη, ∆ρ Βιολογίας
1
Ε.Κ.Φ.Ε. Ευβοίας – Αποµόνωση νουκλεικών οξέων
τους, προσθέτουν στη µεµβράνη σταθερότητα, χωρίς παράλληλα να την
κάνουν στατική. Κάθε µεµβράνη που έχει τη χαρακτηριστική δίστιβη δοµή
που περιγράφηκε ονοµάζεται απλή στοιχειώδης µεµβράνη.
Γενετικό υλικό
Το DNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι πολύπλοκα οργανωµένο. Ο λόγος
είναι ότι είναι ένα γιγαντιαίο µόριο που το µήκος του σε κάθε κύτταρο είναι 2m.
Γι’ αυτό συνδέεται µε πρωτεΐνες, τυλίγεται γύρω τους ώστε να «πακετάρεται»
και να χωρά στο πυρήνα ο οποίος έχει διάµετρο εκατοµµυριοστά του µέτρου.
Έτσι συµµετέχει στη σύνθεση της χρωµατίνης, µιας νουκλεοπρωτεΐνης που
συνίσταται από DNA, από µικρή ποσότητα RNA και από πρωτεΐνες. Η
χρωµατίνη στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου παρουσιάζεται µε
διαφορετική µορφή. Όταν το κύτταρο δεν είναι στη φάση της διαίρεσης η
χρωµατίνη έχει µικρό βαθµό πακεταρίσµατος και παρουσιάζεται µε τη µορφή
ενός πλέγµατος, που λέγεται δίκτυο χρωµατίνης. Όταν το κύτταρο διαιρείται, η
χρωµατίνη συµπυκνώνεται και παίρνει τελικά τη µορφή δοµών, που
ονοµάζονται χρωµοσώµατα.
Αν ξεδιπλώναµε το DNA όλων των κυττάρων του σώµατός µας θα κάλυπτε
την απόσταση γης – ήλιου 1200 περίπου φορές.
Αταµπασίδη Ελένη, ∆ρ Βιολογίας
2
Ε.Κ.Φ.Ε. Ευβοίας – Αποµόνωση νουκλεικών οξέων
Όργανα
Υλικά
2 ποτήρια ζέσεως
Μία µπανάνα
Μια πιπέτα ή σύριγγα των 10 ml
10 ml υγρό πιάτων (όχι συµπυκνωµένο)
Χωνί
Αιθανόλη 95% παγωµένη
∆οκιµαστικός σωλήνας
3 gr µαγειρικό αλάτι
Στήριγµα δοκιµαστικών σωλήνων
Υγρό φακών επαφής ή 0,1gr/100 ml
του ενζύµου πρωτεϊνάση ή πεψίνη
Φίλτρο διήθησης καφέ ή γάζα
Ράβδος ανάδευσης ή καλαµάκι
Γουδί ή πλαστικό σακουλάκι
Μέθοδος
1. Φτιάχνουµε το διάλυµα εκχυλίσεως: σε ένα ποτήρι ζέσεως των 250ml
ρίχνουµε 100ml απιονισµένο νερό και προσθέτουµε 3gr NaCl (µαγειρικό
αλάτι) και στη συνέχεια 10ml απορρυπαντικού (υγρό πιάτων). Ανακατεύουµε
απαλά να διαλυθούν χωρίς να δηµιουργηθεί αφρός.
2. Σε γουδί ή πλαστικό σακουλάκι πολτοποιούµε την µπανάνα.
3. Μεταφέρουµε την πολτοποιηµένη µπανάνα στο διάλυµα εκχυλίσεως και
ανακατεύουµε για 10 min προσέχοντας να µη δηµιουργηθεί αφρός.
4. Τοποθετούµε µία γάζα στο χωνί και φιλτράρουµε το µείγµα του βήµατος 3
συλλέγοντας το διήθηµα σε ένα άλλο ποτήρι ζέσεως.
5. Βάζουµε 10ml από το διήθηµα σε έναν δοκιµαστικό σωλήνα µεγάλης
διαµέτρου.
6. Ρίχνουµε 2-3 σταγόνες υγρού φακών επαφής ή 0,1gr/100 ml του ενζύµου
πρωτεϊνάση ή πεψίνη ανακινώντας ελαφρά.
7. Προσθέτουµε µε προσοχή σχεδόν ίση ποσότητα παγωµένης (-18oC)
αιθανόλης, ώστε να σχηµατιστεί µια ξεχωριστή «φάση» πάνω από το
διήθηµα.
8. Τοποθετούµε το δοκιµαστικό σωλήνα σε ένα στήριγµα δοκιµαστικών
σωλήνων και περιµένουµε 2-3 min. Τα νουκλεϊκά οξέα συγκεντρώνονται στην
επιφάνεια επαφής διηθήµατος – αλκοόλης.
9. Συλλέγουµε το DNA συστρέφοντάς το γύρω από
µία ράβδο ή ένα καλαµάκι.
Αταµπασίδη Ελένη, ∆ρ Βιολογίας
3
Ε.Κ.Φ.Ε. Ευβοίας – Αποµόνωση νουκλεικών οξέων
Επεξήγηση βηµάτων
1. Το NaCl στο νερό διίσταται σε ιόντα Na+
και ιόντα Cl-. Τα ιόντα Na+
εξουδετερώνουν τα ιόντα του φωσφορικού οξέος (PO43-) του DNA και έτσι αυτό
συµπυκνώνεται αφού τα µόρια δεν απωθούνται µεταξύ τους. Σχηµατίζουν έτσι
συσσωµατώµατα οπότε µπορούµε να τα δούµε µε γυµνό µάτι. Επιπλέον τα µόρια
DNA που έχουν χάσει το φορτίο τους έχουν γίνει πιο υδρόφοβα και λιγότερο διαλυτά
στο νερό (γι’ αυτό στο βήµα 8 συγκεντρώνονται στη φάση της αλκοόλης).
Το απορρυπαντικό διασπά τις κυτταρικές µεµβράνες και τον πυρηνικό φάκελο,
καθώς διαταράσσει τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που συγκρατούν τα
φωσφολιπίδια και τις πρωτεΐνες των µεµβρανών. Τα µόρια των απορρυπαντικών,
όπως και των φωσφολιπιδίων, αποτελούνται από υδρόφιλη κεφαλή και υδρόφοβη
ουρά. Τα µόρια και των δύο σε υδάτινο περιβάλλον οργανώνονται σε µυκήλια,
σφαιρικούς δηλαδή σχηµατισµούς, µε τις υδρόφιλες κεφαλές προς τα έξω και τις
υδρόφοβες ουρές προς τα µέσα ώστε να αποφεύγουν την επαφή µε το νερό. Στο
εσωτερικό των µυκηλίων εγκλωβίζονται και τα µόρια των πρωτεϊνών. Το τελικό
αποτέλεσµα είναι η θραύση των µεµβρανών.
2. Χρησιµοποιούµε µπανάνα αντί άλλων φυτικών κυττάρων γιατί οι ιστοί της είναι
µαλακοί και πολτοποιούνται εύκολα και χωρίς τη χρήση ηλεκτρικών συσκευών κάτι
που πιθανόν προκαλούσε σπάσιµο όχι µόνο των κυττάρων αλλά και του DNA.
3. ∆ιαλύουµε την πολτοποιηµένη µπανάνα σε τέτοιο όγκο διαλύµατος ώστε το
οµογενοποίηµα να µην είναι πολύ υδαρές. Είναι σηµαντική η τήρηση του
συγκεκριµένου χρονικού διαστήµατος, ώστε το απορρυπαντικό να καταστρέψει τις
µεµβράνες, αλλιώς δεν θα απελευθερωθεί το DNA.
4. Με το φιλτράρισµα θα κατακρατηθούν τα υπολείµµατα των κυτταρικών τοιχωµάτων
και µεµβρανών, ενώ θα περάσουν τα νουκλεϊκά οξέα. Είναι πιο εύκολο το
φιλτράρισµα µε τη βοήθεια της γάζας σε σχέση µε το φίλτρο καφέ.
5. Χρησιµοποιούµε σωλήνα µεγάλης διαµέτρου ώστε να αυξάνεται η επιφάνεια
επαφής διηθήµατος-αλκοόλης (που θα προσθέσουµε στη συνέχεια).
6. Το υγρό των φακών επαφής περιέχει ένζυµα (πρωτεάσες) που διασπούν τις
πρωτεΐνες µε τις οποίες πακετάρεται το DNA όπως και αρκετές από τις
ενδονουκλεάσες που διασπούν το DNA.
7. Η αιθανόλη έχει µικρότερη πυκνότητα και είναι λιγότερο πολικός διαλύτης από το
διήθηµα και έτσι δεν αναµειγνύεται µε αυτό.
8. Οι υδρόφοβες αζωτούχες βάσεις των νουκλεϊκών οξέων έλκονται από το
υδρόφοβο τµήµα της αλκοόλης και συγκεντρώνονται στην επιφάνεια επαφής
διηθήµατος – αλκοόλης. Επειδή όµως το DNA είναι αδιάλυτο στην αιθανόλη (όσο πιο
κρύα είναι, τόσο περισσότερο µειώνεται η διαλυτότητά της) γίνεται ορατό µε τη µορφή
λευκών συσσωµατωµάτων, ενώ οι πρωτεΐνες κατακρηµνίζονται σε διαλύµατα µεγάλης
περιεκτικότητας σε NaCl
.
9. Η λευκή ινώδης ουσία που παρατηρούµε είναι µίγµα DNA-RNA.
Αταµπασίδη Ελένη, ∆ρ Βιολογίας
4
Ε.Κ.Φ.Ε. Ευβοίας – Αποµόνωση νουκλεικών οξέων
Φύλλο Αξιολόγησης
1. Τι είναι η λευκή ινώδης ουσία που παρατηρούµε στη φάση της
αιθανόλης;……………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………..
2. Σε τι νοµίζετε ότι συνεισφέρει το υγρό πιάτων (σαπούνι) στη διαδικασία
απελευθέρωσης των νουκλεικών οξέων στο διάλυµα;……………………...........
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………….
3. Γιατί χρησιµοποιούµε χλωριούχο νάτριο;……………………………………….
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………….
4. Για ποιο λόγο φιλτράρουµε το διάλυµα; Tι νοµίζετε ότι κατακρατείται στο
φίλτρο και τι περνάει στο διήθηµα;…………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………….
5.
Γιατί
το
DNA
είναι
ορατό
µετά
την
προσθήκη
της
αιθανόλης;……………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
6. Γιατί χρησιµοποιούµε υγρό φακών επαφής ή ένζυµα που διασπούν
πρωτεΐνες;
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
7. Πιστεύετε ότι τα αποτελέσµατα θα ήταν διαφορετικά αν χρησιµοποιούνταν
αντί για µπανάνα άλλο υλικό όπως ακτινίδιο ή κρεµµύδι κ.λ.π………………….
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………..
Αταµπασίδη Ελένη, ∆ρ Βιολογίας
5
Ε.Κ.Φ.Ε. Ευβοίας – Αποµόνωση νουκλεικών οξέων
Βιβλιογραφία
1) http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/
2) http://www.biologyreference.com/index.html
3) http://biotech.biology.arizona.edu/labs/DNA_extraction_onion_studt.html
4) http://www.accessexcellence.org/AE/AEC/CC/DNA_extractions.php
Αταµπασίδη Ελένη, ∆ρ Βιολογίας
6