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MultiMix™
Dual-Colour Reagent
Anti-HumanCD3/FITC
Anti-Human CD4/RPE
Codice N. FR875
Uso Previsto
Per uso diagnostico in vitro.
FR875 è finalizzato per l’uso nella citometria a flusso. CD3 è un antigene ristretto alle cellule Pan-T ed è un
marcatore importante delle cellule T normali e neoplastiche, inoltre, gli anticorpi anti-CD3 sono considerati
essenziali per la valutazione iniziale dei disordini linfoproliferativi acuti e cronici (1). La misurazione del numero
relativo e assoluto di cellule CD4-positive nel sangue periferico è di assoluta importanza nella determinazione
della condizione immunologica di un paziente. L’interpretazione dei risultati deve essere effettuata da patologi
qualificati, nel contesto dell'anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici.
Reagente fornito
FR875 è composto dai due seguenti anticorpi fluorescenti, attentamente accoppiati:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD3, Clone UCHT1, coniugato con isotiocianato di fluoresceina isomero 1
(FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4, Clone MT310, coniugato con R-ficoeritrina (RPE).
I due coniugati di FR875 sono stati prodotti da anticorpi monoclonali murini purificati dell’isotipo IgG1, catena
kappa. FR875 viene fornito in forma liquida, in tampone contenente 1% di albumina serica di bovino (BSA) e
15 mmol/L di NaN3, pH 7,2. Ogni fiala contiene 50 test (10 L di coniugato per max. 106 leucociti presenti nel
sangue periferico umano normale).
Specificità
L’anti-CD3, UCHT1 è stato trattato durante il First and Third International Workshops and Conferences on
Human Leucocyte Differentiation Antigens ed è stato studiato in diversi laboratori, che ne hanno confermato la
reattività con l’antigene CD3 (2). L’anticorpo reagisce con la catena di CD3 (3).
L’anti-CD4, MT310 è stato trattato durante il secondo degli International Workshops and Conferences on
Human Leucocyte Differentiation Antigens ed è stato studiato in diversi laboratori, che ne hanno confermato la
reattività con CD4 (4).
Precauzioni
1. L'uso è destinato ad utenti professionisti.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), un prodotto chimico altamente tossico allo stato puro. Anche
in concentrazioni non classificate come pericolose, il sodio azide potrebbe reagire con le tubature in piombo e
in rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Dopo lo smaltimento, sciacquare con molta acqua per
evitare l’accumulo di azidi metalliche nelle tubature.
3. Questo prodotto contiene materiale di origine animale, pertanto il prodotto essendo potenzialmente infettivo,
deve essere maneggiato con le dovute precauzioni.
Conservazione
Conservare al buio a 2-8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti
vengono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, queste dovranno essere verificate dall’utente.
Non esistono segni evidenti che indichino l'instabilità del prodotto. Per questo motivo, il controllo positivo e
quello negativo devono essere eseguiti contemporaneamente al campione del paziente. Se si dovesse osservare
una colorazione non attribuibile a modifiche delle procedure di laboratorio e se si sospetta un problema relativo
agli anticorpi, contattare il nostro Servizio Tecnico.
Procedura per la colorazione 1.
Riempire una provetta per analisi da 12 mm x 75 mm in polistirene con 100 µL di sangue con anticoagulante
(EDTA).
2.
Aggiungere 10 µL di FR875 e miscelare delicatamente in un miscelatore vortex.
3.
Incubare la provetta al buio a 2–8 °C per 30 minuti o a temperatura ambiente (20–25 °C) per 15–30 minuti.
4.
Aggiungere 100 µL di Uti-Lyse™ Reagent A (codice Dako S3325) nella provetta e miscelare delicatamente
in un miscelatore vortex. Incubare la provetta per 10 minuti al buio, a temperatura ambiente.
5.
Aggiungere 1 µL di Uti-Lyse™ Reagent B (codice Dako S3325) nella provetta e miscelare delicatamente in
un miscelatore vortex. Incubare la provetta per 10 minuti al buio, a temperatura ambiente.
6.
Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 minuti. Aspirare delicatamente il supernatante ed eliminarlo
lasciando circa 50 µL di liquido nella provetta.
7.
Aggiungere 2 µL di PBS (codice Dako S3024) nella provetta e miscelare delicatamente in un miscelatore
vortex.
8.
Ripetere il passaggio 6.
9.
Risospendere le cellule in un liquido adatto alla citometria a flusso, ad esempio 0,3 mL di soluzione PBS .
10.
Analizzare il campione con un citometro a flusso o conservarlo al buio a 2–8 °C fino al momento dell’analisi. I
campioni devono essere analizzati entro 24 ore dalla colorazione.
I coniugati con fluorocromi sono fotosensibili, pertanto i campioni devono essere protetti dalla luce durante la
procedura di colorazione e fino al momento dell’analisi.
(103861-003)
FR875/IT/OKJ/23.05.05 p 1/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Note sulla procedura
Passaggio 1: è facoltativo includere un campione di controllo positivo e un campione di controllo negativo in
ogni ciclo di analisi, in modo da verificare il funzionamento di reagenti e preparati.
Passaggio 2: il volume di coniugato consigliato è soltanto un suggerimento. Le condizioni di colorazione ottimali
possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato, pertanto dovranno
essere definite autonomamente da ogni laboratorio.
È facoltativo includere una provetta con reagente di controllo. Il reagente di controllo deve corrispondere agli
isotipi e ai fluorocromi del reagente anticorpo coniugato. Il reagente di controllo bicromatico consigliato da Dako
per il prodotto FR875 è il reagente con codice X0932.
Passaggi 4 e 5: Se si usa un altro reagente di lisi, seguire le istruzioni corrispondenti. Va sottolineato che se il
reagente di lisi alternativo non contiene un fissativo, quale ad esempio Dako EasyLyse™ (codice S2364), la
soluzione PBS menzionata al passaggio 9 deve contenere paraformaldeide all'1%, tranne nel caso in cui il
campione venga analizzato entro il periodo di tempo consigliato per il reagente di lisi.
Passaggio 10: in alcuni stati patologici, i risultati potrebbero rivelare un numero anomalo di cellule che esprimono
gli antigeni bersaglio oppure cellule con livelli di espressione dell’antigene errati. Ciò potrebbe riflettersi nel pattern
di colorazione. Per eseguire l’analisi in modo corretto, è importante conoscere il normale pattern di espressione
degli antigeni e il modo in cui questi si relazionano all’espressione di altri antigeni pertinenti.
I reagenti policromatici sono da preferirsi ai reagenti monocromatici ai fini dell’esame globale dei campioni con la
citometria a flusso. Il corretto uso della compensazione dei colori assume particolare importanza nelle analisi
policromatiche.
Riferimenti bibliografici
1.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
2.
McMichael AJ, Gotch FM. T-cell antigens: new and previously defined clusters. In: McMichael AJ,
Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White
cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd International Workshop and Conference; 1986 Sept
21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1987. p. 31-62.
3.
Tunnacliffe A, Olsson C, Traunecker A, Krissansen GW, Karjalainen K, de la Hera A. T3.2. The majority
of CD3 epitopes are conferred by the epsilon chain. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP,
Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings
of the 4th International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York,
Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 295-6.
4.
Miedema FT, Terpstra FG, Melief CJM. T cell-dependent immunoglobulin synthesis in the human system.
Studies with T cell-specific monoclonal antibodies. In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID,
editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the 2nd International Workshop on Human Leukocyte
Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston, USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: SpringerVerlag; 1986. Volume I. p. 213-22.
Legenda dei simboli
(103861-003)
Numero di catalogo
Limiti di temperatura
Utilizzare entro
Dispositivo medico-diagnostico
in vitro
Conservare al riparo dalla luce
solare
Fabbricante
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Codice del lotto
FR875/IT/OKJ/23.05.05 p 2/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17