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LE PROTEINE DELL’UVA E DEL VINO: ORIGINE, CARATTERISTICHE E FUNZIONALITA’
Andrea CURIONI e Simone VINCENZI
Dipartimento di Biotecnologie Agrarie, Centro interdipartimentale per la Ricerca in Viticoltura ed Enologia
(CIRVE), Università di Padova
Seminario presentato a Enoforum 2011, Arezzo
Le proteine dell’uva e del vino rappresentano un argomento di studio che negli ultimi anni ha ricevuto
crescente attenzione da parte dei ricercatori, soprattutto a causa del fatto che importanti aspetti
enologici possono essere chiariti attraverso lo studio della loro natura e proprietà. Tra questi, si
riconosce come di primaria importanza la formazione di torbidità nei vini bianchi imbottigliati noto come
“casse proteica” e ben noto agli enologi.
In questo lavoro ci focalizzeremo soprattutto sulle caratteristiche biochimiche e funzionali delle proteine
legate a questo fenomeno.
1. L’origine delle proteine del vino
Sebbene nel vino si possano ritrovare anche proteine derivanti da
microrganismi (soprattutto lieviti, ma anche batteri e funghi) la
maggior delle proteine presenti nel vino finito derivano dall’uva.
L’uva contiene basse concentrazioni di proteine di diversi tipi. Le
più rappresentate vengono sintetizzate a partire dall’invaiatura e si
accumulano nella bacca durante la maturazione seguendo
l’accumulo degli zuccheri (Tattersall et al, 1997). Recentemente,
attraverso un approccio di tipo proteomico, è stato possibile
costruire una mappa delle diverse proteine sia della polpa (cv.
Gamay, Sarry et al., 2004) che della buccia (cv. Cabernet
Sauvignon, Deytieux et al., 2007) dell’uva, mettendo in evidenza
circa 300 proteine diverse (Figura 1).
Figura 1. Analisi elettroforetica
Di queste, 82 sono state analizzate per Matrix-assisted Laser bidimensione delle proteine del
Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry (MALDI- mesocarpo della bacca di Vitis
TOF-MS), identificando 66 diversi componenti, la maggior parte dei vinifera L. cv. Gamay. ( da Sarry
quali coinvolti nel metabolismo energetico (34%), nella risposta a et al., 2004).
stress biotici o abiotici (19%) e nel metabolismo primario (13%)
(Sarry et al., 2004).
In aggiunta agli enzimi metabolici, altre proteine importanti sono presenti a maturità, la maggior parte
dei quali appartiene alla categoria delle cosiddette Pathogenesis-Related (PR) proteins, tra cui le
maggiormente rappresentate sono le chitinasi (famiglia PR3) e le Thaumatin-like proteins (TLP)
(famiglia PR5), che sono le proteine dominanti del succo d’uva matura (Waters et al. 1996), anche se in
quantità diverse in diverse cultivar di V. vinifera (Tabella 1).
Tabella 1. Quantità di proteine totali, chitinasi e Thaumatin-like proteins in diverse cultivar di
V.vinifera (da Pocock et al., 2000).
Proteine totali
TLP
Chitinasi
Brix
(mg/mL)
(mg/mL)
(mg/mL)
Moscato di Alessandria
20.6
251
119
118
Sauvignon blanc
21.5
191
119
76
Sultana
21.0
86
23
44
Pinot nero
20.2
62
35
21
Shiraz
20.8
31
18
9
Cultivar
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Nei diversi tessuti di V. vinifera sono presenti diverse forme di chitinasi, ma la più alta attività
enzimatica si trova nella bacca (Derckel et al., 1996). Queste proteine sono coinvolte nei meccanismi di
difesa della pianta dagli attacchi dei patogeni fungini, essendo in grado di idrolizzare la chitina, un
componente strutturale della parete cellulare del fungo
In Moscato d'Alessandria sono state purificate quattro chitinasi le cui sequenze aminoacidiche erano
molto simili (Waters et al., 1998). Queste proteine hanno una mobilità elettroforetica in SDS-PAGE
compresa tra 32 e 34 kDa, anche se il loro reale peso molecolare (MW), misurato per spettrometria di
massa è molto inferiore (tra 25 e 26 kDa) (Pocock et al. 2000). Nonostante la presenza di diverse
isoforme di chitinasi, che potrebbero derivare o dalla espressione di diversi geni (Busam et al, 1997;
Robinson et al., 1997) o da fenomeni di proteolisi limitata (Waters et al., 1998), l'isoforma più
importante sembra essere una chitinasi di classe IV (che contiene un dominio in grado di legare la di
chitina), che è altamente espressa durante maturazione della bacca (Robinson et al., 1997). In effetti,
questa è la sequenza determinata nelle bacche mature di Gamay da Sarry et al., (2004) (27,2 kDa, pI
5,4) e anche in Cabernet Sauvignon (27,53 kDa, pI 5,38, Vincent et al., 2006).
L'altra classe principale di proteine della bacca d'uva sono le TLP (Tattersall et al., 1997). Oltre alla
isoforma principale denominata TLP VVTL1, è stata rilevata almeno un’altra forma minore di TLP
(Pocock et al., 2000). Queste proteine mostrano, rispettivamente, un peso molecolare apparente di 24
e 25 kDa in SDS-PAGE, ma la loro massa, determinata mediante spettrometria ESI-MS è di 21,272 e
21,260 kDa (Pocock et al., 2000).
Anche se sono costitutivamente espresse nella bacca, le PR-proteins possono essere indotte da
attacco di patogeni (Busam et al, 1997; Jacobs et al, 1999), così come da altri stimoli ambientali di
natura chimica e fisica, come lesioni fisiche (Derckel et al., 1998), e stress da siccità.
In effetti alcuni autori hanno osservato un aumento nell’espressione delle PR-proteins (in particolare
chitinasi,TLP e beta glucanasi) in uve infettate da patogeni (Oidio), con corrispondente aumento della
instabilità proteica del vino (Girbau et al., 2004). Al contrario, infezioni da Botrytis cinerea sembrano
ridurre il contenuto in PR-proteins sia in vivo che in vitro. Questo è stato imputato all’azione di enzimi
proteolitici secreti dal fungo (Marchal et. al 1998), anche se invece sembra che il meccanismo di
scomparsa delle PR-proteins sia dovuto a fenomeni di co-ossidazione proteine-polifenoli indotti
dall’azione della laccasi (Favaron et al., 2009).
Per quanto riguarda l’effetto dello stress da siccità, l’idea riportata da molti che stagioni secche
determinino una maggiore instabilità proteica non trova riscontro in una maggiore produzione di PRproteins nell’uva, la cui quantità assoluta nella bacca pare non risentire delle condizioni di irrigazione
(Pocock et al. 2000).
Anche la raccolta meccanica, procurando un certo danneggiamento fisico alle bacche potrebbe avere
un effetto sulla sintesi di proteine PR, ma è stato dimostrato che la maggiore instabilità del vino derivato
da uve raccolte meccanicamente è dovuto non a una maggiore sintesi in risposta alle lesioni fisiche
quanto ad una maggiore estrazione di proteine dalle bucce (Waters e Colby, 2009).
2. Caratteristiche biochimiche e strutturali
Le proteine che passano dall’uva al vino e che possono poi determinarne l’instabilità sono,
paradossalmente, quelle più stabili al processo di vinificazione. Delle centinaia di specie proteiche
contenute nel succo d’uva, solo una piccola frazione è capace di resistere agli effetti del processo di
vinificazione. L’abbassamento del pH, la presenza di alcol e di attività proteolitiche sono tutti fattori che
causano fenomeni di denaturazione e degradazione delle proteine che hanno come conseguenza il
fatto che si produce una “selezione” per cui solo quelle più resistenti rimangono nel vino dopo
fermentazione. Essendo influenzato sia dal contenuto proteico della bacca che dal sistema di
vinificazione, il contenuto proteico nei vini bianchi è molto variabile. In letteratura si riportano contenuti
proteici variabili da meno di 1 mg/L fino a più di 1 g/L, sebbene i metodi analitici utilizzati per la loro
misura abbiamo certamente un effetto sui risultati ottenuti (Vincenzi et al., 2005). Più realisticamente si
potrebbe dire che i livelli di proteine che si riscontrano normalmente nei vini vadano da 10 a circa 250
mg/L.
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Le proteine che hanno le caratteristiche per sopravvivere alla
vinificazione sono le PR-proteins, che per loro natura hanno una
resistenza intrinseca alla proteolisi e alla denaturazione (Waters et al.,
1992). Infatti confrontando i pattern elettroforetici delle proteine dell’uva
con quelli dei vini si può notare una forte semplificazione con poche
componenti principali che rimangono dopo la vinificazione, che
mostrano pesi molecolari compresi tra 20 e 30 kDa e p.I. di 4–6 (figura
3).
Figura 3. 2D-PAGE delle
proteine del vino (cv. Incrocio
Manzoni Bianco) (Polesani,
2004).
Queste componenti sono state identificate come chitinasi e TLP dell’uva
(Waters et al., 1996). Inoltre, anche l’invertasi (MW 62-64 kDa) è
considerata una delle più abbondanti proteine del vino, rappresentando
dal 9 al 14% del contenuto proteico totale (Dambrouck et al., 2005).
Tuttavia, per ogni MW, si possono evidenziare parecchie macchie proteiche (figura 3), il che suggerisce
la esistenza di una certa micro-eterogeneità, probabilmente derivante da proteolisi limitata o da
modificazioni chimiche subite durante la vinificazione dalle proteine dell’uva (Monteiro et al., 2001).
Comunque, questa idea è stata recentemente messa in dubbio in quanto si è visto che già nell’uva
esistono varie forme della stessa proteina (Monteiro et al., 2007).
Oltre che per dimensioni molecolari e punto isoelettrico le proteine si differenziano anche per la loro
idrofobicità, una caratteristica importante dal punto di vista funzionale poiché può condizionare
l’interazione con altri componenti, come per esempio i tannini.
Separando le proteine del vino in base a questa caratteristica si ottengono molte frazioni diverse (figura
4), identificabili, tramite MS, principalmente come chitinasi e TLP dell’uva.
Figura 4: Separazione delle
proteine tramite cromatografia di
interazione
idrofobica
ed
identificazione delle proteine dei
picchi (Marangon et al., 2009).
Le proteine del vino si caratterizzano per avere strutture globulari compatte, molto raggomitolate e
stabilizzate da un numero di legami disolfuro intermolecolari variabile da 6 a 8.
L’importanza dei legami disolfuro nel mantenere la compattezza della
molecola può essere dimostrata anche tramite elettroforesi in condizioni
riducenti e non riducenti in cui si vede che la riduzione, provocando una
apertura delle molecola, ne fa aumentare il peso molecolare apparente,
per cui la migrazione risulta ritardata rispetto alla molecola in forma
compatta (figura 5)
Figura 5: analisi per SDS-PAGE delle proteine dell’uva (1
e 3) e del vino (2 e 4) in condizioni riducenti (1 and 2) e
non-riducenti (3 e 4). I pesi molecolari (MW in KDa sono
indicati sulla sinistra (Vincenzi and Curioni, 2005).
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La perdita della struttura per denaturazione termica, un passaggio ritenuto necessario per la
aggregazione delle proteine e la formazione di torbidità (vedi sotto) è stato studiato tramite calorimetria
differenziale (DSC) e dicroismo circolare (Falconer et al., 2010), tecniche che consentono di seguire i
cambiamenti che la struttura della proteina subisce a temperature crescenti.
Dai risultati ottenuti con queste tecniche si è potuto dimostrare che le chitinasi hanno una temperatura
di denaturazione (Tm ) inferiore rispetto alle TLP e che la denaturazione delle TLP, a differenza di quella
delle chitinasi, è un fenomeno parzialmente reversibile (Tabella 2)
Tm (°C)
Reversibilità della
denaturazione
chitinasi (classe IV)
55
No
TLP (VVTL1)
62
Sì (parziale)
Proteina
Tabella 2. Temperature di
denaturazione (Tm) di chitinasi e
TLP purificate (Falconer et al., 2010).
Sulla base dei dati ottenuti si è potuto calcolare che la chitinasi ha una emivita di 9 anni a 15 °C, 1.3
mesi a 25 °C, 4.7 giorni a 30 °C e 17 min a 45 °C.
Nel loro insieme questi dati indicano che trattamenti termici come quelli adottati dalle prove di stabilità
al calore (heat test), essendo molto più intensi delle temperature di denaturazione di entrambi i tipi di
proteine, potrebbero non rispecchiare le differenze di sensibilità termica tra chitinasi e TLP alle
temperature cui viene sottoposto il vino in condizioni reali.
3. Il comportamento e la funzionalità nella formazione di torbidità
La formazione di torbidità proteica nei vini bianchi è quasi sicuramente dovuta a un meccanismo che
vede un primo passaggio nella denaturazione delle proteine cui seguono fenomeni di interazione che
portano ad aggregazione e flocculazione in precipitati visibili.
La denaturazione delle proteine sembra essere il passaggio limitante in termini di energia di
attivazione. Una volta che le proteine sono denaturate, l’aggregazione e la formazione di particelle
avviene con facilità.
La presenza nel vino di almeno due tipi principali di proteine, le chitinasi e le TLP, implica che i
fenomeni di denaturazione debbano essere riferiti alle caratteristiche di ognuna di esse. Studi recenti
hanno in effetti dimostrato che le temperature di denaturazione delle chitinasi sono inferiori a quelle
delle TLP (vedi sopra).
Oltre alla temperatura, però, altri fattori sembrano essere coinvolti nel fenomeno della precipitazione
proteica nei vini. Questi fattori agirebbero sulla entità della denaturazione e/o su quella della
aggregazione che ne consegue e tra questi alcuni (il cosiddetto fattore X) sembrano essere necessari
per lo sviluppo di torbidità. In effetti le sole proteine purificate dal vino, non sono in grado di produrre
torbidità quando riscaldate in vino modello (soluzione acquosa di alcol al 12% contenete acido tartarico
a pH 3,2), ma possono farlo se riaggiunte in vino ultrafiltrato (cioè deprivato delle proprie
macromolecole). Sembra quindi che il fattore X, di natura non proteica, sia necessario alla formazione
di torbidità. In effetti è stato dimostrato che ioni, polifenoli e polisaccaridi possono modulare la
formazione di torbidità nei vini bianchi. Il fenomeno è quindi assai complesso e, di fatto, non ancora
chiarito.
I sali influenzano la stabilità delle proteine modificando la forza ionica delle soluzioni ed interagendo
con le cariche portate dalle proteine. Questo porta da una parte a facilitare la denaturazione della
molecola proteica e dall’altra a favorire le interazioni tra una proteina e l’altra. La forza ionica dei vini è
compresa tra 10 and 100 mM e quindi si potrebbe supporre che le differenze in questo parametro
possano influenzare fortemente le interazioni elettrostatiche. In effetti questo è stato dimostrato in un
sistema modello contenente chitinasi purificate dal vino (Marangon et al., 2011).
Inoltre, i meccanismi coinvolti possono dipendere anche dal tipo di ione. Per esempio, lo ione solfato è
stato indicato come il fattore X necessario perché si possa avere denaturazione e torbidità proteica nei
vini (Pocock et al., 2007).
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Un successivo lavoro ha esaminato in dettaglio l’effetto del solfato sulle proteine del vino confermando
una maggiore suscettibilità delle chitinasi alla formazione di torbidità in presenza di questo ione,
arrivando a costruire un modello che tiene conto del diverso comportamento delle due classi di proteine
(chitinasi e TLP) quando sottoposte al trattamento termico per cui le chitinasi, subendo una totale
denaturazione irreversibile si aggregano fin dal momento del riscaldamento, mentre le TLP si lo fanno
solo in parte al momento del raffreddamento.
Uno studio ulteriore ha confermato che le chitinasi sono le componenti proteiche maggiormente
coinvolte nel fenomeno della torbidità proteica, soprattutto in presenza di solfato (Marangon et al.
2011). Le proteine maggiormente rappresentate nei precipitati ottenuti da un vino mantenuto a
temperature di 30°C per 22 ore (quindi in condizioni simili a quelle che possono incontrare in vini reali)
sono in effetti chitinasi, mentre le TLP tendono a rimanere in soluzione
La presenza di tannini nel vino deve comunque essere considerata un fattore con possibili grandi effetti
sulla precipitazione delle proteine, come riportato da anni in letteratura.
Tra le interazioni che possono instaurarsi tra tannini e proteine e che possono condurre alla formazione
di particelle flocculate le interazioni idrofobiche svolgono un ruolo centrale. Separando le proteine del
vino in base alle loro caratteristiche di idrofobicità si sono ottenute diverse frazioni la cui reattività con i
tannini purificati dallo stesso vino cresceva con il grado di idrofobicità della frazione (Marangon et al.,
2010). La maggiore torbidità si sviluppava quando la reazione con i tannini veniva condotta a caldo (a
temperature superiori a quelle di denaturazione delle proteine), mentre a temperatura ambiente (RT) la
torbidità sviluppata era molto minore (figura 6).
Figura 6: reattività con i
tannini del vino di frazioni
proteiche a diversa
idrofobicità (Marangon et al.,
2010)
Questi dati sperimentali consentono di elaborare il seguente modello di interazione: le proteine del vino
sono raggomitolate a RT, con le porzioni idrofobiche nascoste all’interno della struttura, che si presenta
compatta. Tuttavia, qualche molecola di tannino (presente anche nei vini bianchi) può essere legata
alla superficie esterna della molecola, ma in modo tale da non consentire la reticolazione tra molecole
proteiche diverse: tutti i siti di legame con i tannini sono occupati. Il riscaldamento provoca l’apertura
della struttura delle proteine (denaturazione termica) provocando l’esposizione di porzioni idrofobiche,
inizialmente nascoste, che agirebbero
come nuovi siti di legame per i tannini.
Su questi siti potrebbero legarsi i tannini
già inizialmente presenti sulla struttura
esterna delle proteine, provocando così
la reticolazione e la precipitazione del
complesso (formazione di torbidità)
(figura 7).
Figura 7: modello di interazione tra
proteine e tannini dei vini bianchi
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Da tutti questi studi appare evidente come la ricerca, negli ultimi anni, stia procedendo verso una
caratterizzazione sempre più dettagliata delle proprietà biochimiche e funzionali delle proteine del vino.
Questi studi hanno come presupposto che solo la conoscenza approfondita dei fattori e dei meccanismi
di base coinvolti nei fenomeni determinati dalla presenza di proteine nei vini possa portare, attraverso
un approccio razionale, alla individuazione di interventi tecnologici mirati, da una parte, alla soluzione di
problemi pratici e, dall’altra, alla valorizzazione della qualità del vino.
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