Transcript Presentasi hasil HB 2009

DIVERSITAS GENETIK VIRUS DENGUE DAN NYAMUK
VEKTOR DI DAERAH ENDEMIK DEMAM BERDARAH
DENGUE (DBD) DI KOTA PADANG DENGAN METODE
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Oleh:
Dra. Hasmiwati, M.Kes.
Dr. Dahelmi, MS
dr. Nurhayati, M.Biomed.
Pendahuluan
• DBD masalah kesehatan serius
• KLB tahun 1970–1990 terjadi 4–6 thn
Sekarang  3-4 thn  1-2 thn
• Virus dengue ditularkan nyamuk: Aedes spp.
• Terjadinya diversitas genetik nyamuk populasi nyamuk
tinggi , prevalensi penyakit meningkat.
• Terjadinya diversitas genetik nyamuk vektor
memungkinkan terjadi diversitas genetik serotype virus
dengue yang ditularkannya
• Penularan virus dengue terjadi secara horizontal dan
vertikal (transovarian).
• Apakah dengan terjadinya diversitas genetik nyamuk
vektor juga terjadi diversitas serotype virus dengue?
• .Deteksi virus dengue dengan RT- PCR
• .Virus Dengue adalah Virus RNA
• .Variasi genetik virus dengue terjadi antara serotype
dan juga dalam serotype tergantung waktu dan
daerah penyebaran.
• .Beberapa peneliti yang telah mendeteksi virus
dengue pada nyamuk :Chow et al (1998),Harris, et
al (1998),Johnson et al (2005),Liotta et al (2005).
• .
Tujuan Penelitian
• Tahun I
• Mengoleksi dan mengidentifikasi nyamuk vektor DBD
(telur,larva dan dewasa)
• Mengetahui serotype virus dengue dari nyamuk vektor
dengan metoda RT-PCR
• Menganalisis diversitas genetik serotype virus dengue
dibanding dengan isolat Genebank
• Tahun II
• Menganalisis diversitas genetik nyamuk vektor DBD dengan
metoda RAPD-PCR
• Mengetahui perkembangan ke 4 serotype virus dengue
pada nyamuk vektor.
Manfaat Penelitian
1.Informasi nyamuk vektor DBD
2.Serotype virus dengue
3.Diversitas genetik serotype virus dengue
4.Diversitas genetik nyamuk vektor
Metode Penelitian
1.Lokasi Penelitian
Daerah endemik,sporadik dan potensial DBD di Kota
Padang Sumbar.
2. Pelaksanaan Penelitian
Tahun I
a. Koleksi dan identifikasi nyamuk vektor
b. Isolasi virus dengue dari nyamuk vektor
c. Elektroforesis
d. Amplifikasi RNA virus dengue: RT-PCR
e. Elektroforesis
f. Sequencing
Metode Penelitian
•
1.
2.
3.
Tahun II
Isolasi DNA nyamuk vektor
Amplifikasi DNA nyamuk: RAPD-PCR
Elektroforesis
4.
Diversitas Genetik virus DEN pada Nyamuk
 Menginokulasikan virus dengue ke 4 serotipenya pada
nyamuk dewasa secara intrathorasik
Dipelihara 14 hari, diisolasi virus, di
amplifikasi RT-PCR dan di sequensing serta dibandingkan
dengan isolat Genbank.
Komposisi Reaksi 1 step RT-PCR
Komponen
Volume/Raksi
Rnase free water
7,5 μl
5x Qiagen 1 step RT PCR buffer
10,0 μl
d NTP Mix
2,0 μl
5x q solution
10,0 μl
Primer DF
3,0 μl
Primer DR1
3,0 μl
Primer DR 2
1,5 μl
Primer DR 3
1,5 μl
Primer DR 4
1,5 μl
Qiagen 1 step RT PCR enzym
2,0 μl
RNA (Template)
8,0 μl
Total
50,0 μl
Program Reverse Transkriptase dan Amplifikasi :
Reaksi
Suhu
(ºC )
Waktu
(menit)
Reverse Transcriptase (RT)
50
30
Initial PCR
95
15
Denaturation
94
1
Annealing
55
1
Extension
72
1
Final extension
72
10
Jumlah
siklus
40 x
Analisis Data
1. Serotype virus dengue: Dengan program Clustal X
Pohon filogenetik: distance method, parsimony dan
likehood method, menggunakan software Philip versi
3.5c PAUP*Ver.4.10b
2. Diversitas genetik serotype virus dengue: sama dgn 1
3. Diversitas genetik nyamuk vektor: Menggunakan
program NTSYs-PC, Gambaran dendrogam: UPGMA
Hasil dan Pembahasan
• 1. Distribusi Kasus DBD
• Hasil Survei kasus DBD Jan s/d Mei
• 2009 di : RSU BMC : 89 kasus
•
RS Yos Sudarso : 130 kasus
•
RSUD :118 kasus
• tersebar di 11 kec. Di kota Padang
Jenis dan karakter sampel
Tabel 3. Jenis dan Jumlah sampel nyamuk berdasarkan lokasi penelitian
Jenis nyamuk
Lokasi
Jumlah individu
♂
♀
Jumlah
Aedes aegypti
Belimbing*
104
179
283
Aedes aegypti
SD I B. Mulia*
152
150
302
Aedes aegypti
Gadut*
94
94
188
Aedes albopictus
Gadut*
58
53
111
Aedes aegypti
SD I B. Mulia**
78
65
140
Aedes aegypti
Gadut**
102
194
264
585
696
1288
Total
• Hasil Isolasi Virus Dengue pada nyamuk
1. RNA virus dari serum
2. 3. RNA virus A. aegypti jantan
4. RNA virus A. aegypti jantan dan betina
5. RNA virus A. aegypti betina
6. RNA virus A. aegypti jantan
7. RNA virus A. aegypti jantan dan betina
8. RNA virus A. aegypti betina
9. -
Gambar 1.Elektroferoragram RNA Virus Dengue Lokasi Gadut
1. RNA virus A. aegypti jantan dan betina Gadut
2. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru
3. RNA virus A. aegypti jantan Sp. Haru
4. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru
5. RNA virus A. aegypti jantan dan betina Sp. haru
6. RNA virus A. albopictus jantan dan betina Gadut
7. RNA virus A. aegypti betina Belimbing
8. RNA virus A. aegypti jantan Belimbing
•
Gambar 2 :Elektroferogram RNA Virus Dengue Lokasi SDI BM (Simp.Haru)
• Amplifikasi RNA Virus Dengue
M. Marker
1. RNA virus dari serum
2. RNA virus A. aegypti betina
3. RNA virus A. aegypti jantan
4. RNA virus A. aegypti jantan & betina
5. RNA virus A. aegypti betina
6. RNA virus A. aegypti jantan
7. RNA virus A. aegypti jantan & betina
•
Elektroferogram Virus Dengue dengan RT-PCR Lokasi Gadut.
Elektoferogram Virus dengue Dengan
RT-PCR lokasi SDI BM (Simp.Haru).
M. Marker
1. Kontrol negatif
2. RNA virus A. aegypti jantan dan betina Gadut
3. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru
4. RNA virus A. aegypti jantan Sp. Haru
5. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru
6. RNA virus A. aegypti jantan dan betina Sp. haru
7. RNA virus A. albopictus jantan dan betina Gadut
Kesimpulan
1. Seluruh kecamatan kota Padang endemik DBD.
2. Ae.aegypti dan Ae.albopictus, vektor DBD di kota
Padang
3. Serotype virus dengue yang dapat dideteksi pada
kedua jenis nyamuk diduga serotype 2 (Den 2).
Saran
1. Deteksi Virus dengue pada nyamuk vektor perlu dilakukan
secara terus menerus sepanjang tahun untuk mengantisipasi
terjadi KLB DBD.
2. Variasi genetik serotype virus perlu diketahui untuk
mempelajari patofisiologi DBD.
Rencana penelitian tahun II
1. Mengetahui Diversitas genetik nyamuk vektor.
2. Mengamati perkembangan virus Den 1, 2, 3 dan 4
pada nyamuk vektor.
TERIMA KASIH
Rencana Tahun II
• Dari hasil koleksi dan Identifikasi nyamuk vektor DBD di kota Padang
ternyata telah didapatkan bahwa nyamuk yang berperan sebagai vektor
DBD di kota Padang adalah nyamuk Ae. aegypti dan Ae. albopictus. Serta
telah dilakukan deteksi virus dengue pada nyamuk ini dan didapatkan
bahwa virus dengue yang terdeteksi adalah virus dengue serotype 2 yang
didapatkan pada nyamuk Ae. Aegypti dan Ae.albopictus.
• Untuk mengetahui diversitas genetik virus,mengetahui kemampuan
perkembangan virus dengue pada nyamuk vektor dan diversitas nyamuk
vektor perlu dilakukan penelitian lanjutan tahun kedua. Karena dengan
diketahui diversitas genetik nyamuk vektor dan diversitas virus pada
nyamuk ini di harapkan sangat penting untuk membantu dalam
pengendalian dan pengontrolan nyamuk vekor DBD serta meningkatkan
kewaspadaan dini dalam menekan terjadinya kejadian luar biasa (KLB)
DBD yang menimbulkan masalah serius dimasa yang akan datang serta
bisa dipersiapkan untuk kandidat vaksin DBD.
Isolasi RNA Virus
Isolasi Virus Dengue dgn Kit Isolasi RNA Viral Qiagen (QiAmp Viral RNA mini kit}
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
30 ekor nyamuk dimaserasi dlam 60 μl PBS.
Digerus dengan pelet pestel
Ditambah 560 µl buffer AVL yang telah dipanaskan 80ºC.
Tambahkan 5,6 ul RNA carrier + buffer AVL.
Vortex 15 detik.Inkubasi 10 menit pada suhu kamar.
Sentifus singkat,Tambahkan 560 ul etanol absolut.
Vortex 15 detik dan sentrifus singkat.
Diambil 630 μl larutan ,masukakan ketabung pengumpul.
Sentrifuse,8.000 rpm 1 menit, ulangi sampai semua lisat habis.
Buang tabung yang berisi lisat dan ganti dengan tabung baru tambahkan
500 µl buffer AW1, sentrifuse 8.000 rpm selama 1 menit.
Buang tabung yg berisi filtrat ganti tabung baru ,tambahkan 500 μl buffer AW2
,sentrifuse 14.000 rpm selama 3 menit.
Buang tabung yang berisi filtrat ganti dengan tabung baru.tambahkan 60 μl buffer
AVE, inkubasi 1 menit pada suhu kamar.
Sentifuse 8.000rpm 1 menit
Simpan pada -20 ºC. untuk diamplifikasi.
Primer RT-PCR
•
•
•
•
•
•
Primer yang digunakan adalah :
DF: 5 TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G 3
DR1: 5 CGT CTC AGT GAT CCG GGG G 3
DR2: 5 CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG 3
DR3: 5 TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C 3
DR4 : 5 TGT TGT CTT AAA CAA GAG AGG TC 3
Elektroforesis
-Hasil isolasi RNA dielektroforesis pada agarose 1.5 % dalam
1% BBE ( Borate Boric EDTA pH 7,5).
- Hasil Amplifikasi dielektoforesis pada agarose 2% dalam 0,5
TBE (Tris Borate EDTA}.
-Divisualisasi ,uv transluminator,foto polaroid
-Pita yang diharapkan 486 bp D1,119 bp D2,290 bp D3 dan
389 bp D4.
Sequensing
Penentuan urutan nukleotida serotype virus yang didapat di
lakukandi PT. Charoen Pokhan Indonesia.
Pohon Filogenetik
Dengan program software berdasarkan
metoda statistik:
Distanced methode
jarak evolusinya dihitung untuk semua pasangan taxa dan pohon filogenetik
dibuat berdasarkan hubungan diantara nilai nilai jarak tersebut.
Parsimoni methode
didasarkan pada jumlah terkecil subsitusi nukleotida yang menjelaskan
keseluruhan proses evolusi untuk membuat pohon filogenetik
Likehood methode
didasarkan pada perhitungan jumlah kemungkinan pola variasi site yang
dihasilkan oleh proses subsitusi dan frekwensi basa yang diamati.
Metode Thn II
Isolasi DNA
nyamuk(Hoelzel,1994)
100ul buffer CTAB 10x
Dipanaskan pada waterbath 10 menit 60 C
Tambahkan 1 ekor nyamuk ,gerus
Tambah 5 ul proteinase K dan 1ul 2mercaptoethanol
Di vortek dan diinkubasi pada waterbath ,2 jam,60 C
Tambahkan 200 ul TE(50mM Tris/10mM,ph 8) dan200 ul phenol dan 200 ul kloroform: isoamil;alkohol(24:1)
Sentrifus 13.000 rpm ,10 menit
Supernatan pindah ke tbg baru tambah 200 ul kloroform: isoamil alkohol (24:1)
Sentrifuse 13.000 rpm, 10 menit
Supernatan diambil tambah 200ul isopropanol
Presipitasi dalam freezeer shu -20oC selama 1 malam
Disentrifus 13.000 rpm 10 menit,pellet diambil tambah 200 ul TE(50 mM Tris/10 mMEDTA,ph 8) tambah 20 ul
ammonium asetat dan 500 ul alkohol absolut.
Dipresipitasi pada suhu -70oC 1 jam
Sentifus 13.000 rpm,10 menit
Larutan dibuang pellet ditambah 500 ulethanol 70% dingin
Disentrifus 13.000 rpm ,5 menit
Pelet dikering kan dan dilarutkan dengan 50 ul TE (Siap diamplifikasi)
Reaksi RAPD-PCR
(William et.al.,1990)
-2,5 ul buffer PCR
-2,5 ul Mgcl2 25 mM
-0,2 ul d NTP (dATP,dCTP,dGTP dan dTTP)
-0,2 ul Taq polymerase
-3-5 ul DNA
-2,0 ul primer
- untuk total 25 ul tambah mineral oil
- kontrol negatif tanpa DNA
-semua komponen dalam aliqout
Siklus PCR yang digunakan:
• -Denaturasi awal 94oC 4 menit 1x
-Denaturasi 94oC, 1 menit
-Annealing 35oC ,1 menit
-polimerisasi 72oC ,10 menit
-sampel disimpan 4oC ,1 malam
Primer yang dipakai:
OPE 17 :5' CTACTGCCGT 3'
OPF 4 :5' GGTGATCAGG 3'
OPF 2 :5' GAGGATCCCT 3'
COI : 5' TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT 3'
Elektroforesis
• - Hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel
elektroforesis 1,2 % pada larutan TBE 1x
(Sambrook et al., 1989)
-Divisualisasi , uv transluminator,foto polaroid
-Pita DNA hasil amplifikasi diskor 1 dan 0
dianalisis dengan NTSYs-PC
- Polimorfisme : pita DNA yang tdk selalu hadir pada
semua sampel
monomorfisme:pita DNA yg selalu hadir pada semua
sampel
Inokulasi virus pada nyamuk
Teknik Inokulasi, jarum dan alat suntik yang dipergunakan
adalah menurut cara Rosen dan Gubler (1974). Serum yang
akan diinokulasikan diencerkan dalam garam dapar fosfat pH
7,4 yang mengandung 0,5% gelatin dan 5% serum anak sapi
yang dipanaskan selama 30 menit pada suhu 56 oC.
Nyamuk Aedes jantan dan betina didapat dari lapangan
dengan pengoleksian telur (Ovitrap) setelah itu dipelihara di
laboratorium sampai dewasa dengan pemberian makanan
buatan. Serum yang mengandung Virus dengue disuntikan
pada nyamuk yang telah dibius dengan menggunakan
tabung kapiler yang ujungnya runcing (diruncingkan diatas
nyala api). Nyamuk yang telah diinokulasi dipelihara
dilaboratorium selama 10 – 14 hari hari dengan memberi
makan nyamuk dengan larutan gula 10 %.
• Hasmiwati : Ketua peneliti
- Survey,koleksi sampel,identifikasi nyamuk vektor,
isolasi RNA/DNA,amplifikasi,mmengolah
data,membuat laporan.
• Djong Hon Tjong : anggota peneliti
- isolasi RNA/DNA, amplifikasi,analisis data
• Dahelmi : anggota peneliti
- Koleksi sampel,identifikasi nyamuk vektor,membuat
laporan
• Nurhayati : anggota peneliti
-koleksi sampel, identifikasi nyamuk,analisa data