Transcript Scienze cliniche applicate e biotecnologiche

PRECIPITAZIONE
FRAZIONATA DI PROTEINE
Obiettivo:
separare proteine sfruttando
differenze di solubilità
SOLUBILITA’ DELLE
PROTEINE
• pH
• FORZA IONICA
• SOLVENTI
• POLIMERI ORGANICI
• TEMPERATURA
Effetto del pH
Precipitazione isoelettrica
• Si modifica il pH avvicinandolo al pI
• Può essere utilizzata per allontanare
proteine estranee o per purificare la
proteina desiderata
Ioni in acqua
•
Gli ioni interferiscono con la struttura naturale
dei legami idrogeno dell’acqua
• L’effetto netto è la riduzione della viscosità
• Alcuni ioni si comportanoi come
• agenti chaotropi o denaturanti distruggono
le interazioni intramolecolari che
stabilizzano le macromolecole
• agenti cosmotropi o stabilizzanti rinforzano
la struttura dell’acqua (interazioni idrogeno
dell’acqua forti ) così stabilizzando le
interazioni intermolecolari tra le proteine
La relazione tra solubilità di un sale e la forza
ionica è esponenziale
log S = β - kS μ
Relazione di Cohn, dove:
μ = ½ Σ ci zi2 forza ionica
solubilità a μ = 0
β = log S0
kS
costante di “salting-out”
dipende dal sale e dalla proteina
Efficacia precipitante dei sali.
La serie di Hofmeister (1888)
Effetto cosmotropico crescente
(stabilizzanti e precipitanti)
Cationi: NH4+ > Cs + > Rb+ > K+ > Na+ > Mg++ > Ca++ > Al3+
Anioni: citrate3- > SO4-- > HPO4-- > Cl- > I- > NO3- > ClO4- > SCNEffetto chaotropico crescente
(denaturanti)
L’effetto chaotropo è legato alla capacità di penetrare il bilayer
lipidico
Jonathan N. Sachs† and Thomas B. Woolf
J. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 8742-8743
CH2OH
O
OH
OH
OH O
OH
OH
OH
O
CH2OH
Il trealosio (α,α-glucosio) è un agente cosmotropo
Abbondante nell’emolinfa degli insetti
Effetto della forza ionica
Salting-out
Salting-in
Precipitazione frazionata con ammonio solfato
• Sale molto solubile e buon precipitante
• La concentrazione si esprime in % saturazione
(soluzione satura: circa 4 M)
• Si può aggiungere sale solido oppure una
soluzione satura
• Si procede per aggiunte successive
• La tecnica non è denaturante
• La densità delle proteine è maggiore della
soluzione (non vero per sale di potassio)
Frazionamento con solventi
organici
• Si usano solventi polari (acetone, metanolo,
etanolo, dimetil-solfossido…)
• Diminuisce la costante dielettrica del mezzo
e aumentano le interazioni soluto-soluto
• Occorrono temperature basse (forte rischio
di denaturazione)
• Pericoloso su larga scala (infiammabilità)
Precipitazione con solventi.
Acetone a 0°C e pH 6.5
Frazionamento con polimeri organici
• Rimuovono acqua di idratazione dalle
proteine
• Si utilizzano polimeri idrofili come il polietilenglicole (PEG) con massa molecolare
6000-20000
Effetto della temperatura
• In
un certo intervallo, parte delle proteine
globulari aumentano la solubilità con T
•A
T > 40° C, molte proteine tendono a
denaturarsi e a precipitare
• L’aumento
di temperatura può essere
impiegato per precipitare proteine termolabili, recuperando proteine termostabili
DIALISI e
ULTRAFILTRAZIONE:
OBIETTIVO
Separare molecole o particelle tramite
una membrana semi-permeabile,
sfruttando differenze di dimensioni
Dialisi
Passaggio di molecole (cristalloidi) secondo
gradiente di concentrazione attraverso le
membrane . Le membrane sono impermeabili
alle macromolecole (colloidi) e sono dette
MEMBRANE DA DIALISI
h
M
c
H2O
M
c
h = pressione oncotica,
c
pressione osmotica dovuta alle
macromolecole
Dialisi selettiva
ab
ab
c
d d
A
B
c
ab
d
A
c
ab
d
B
Ripetere per rimuovere
completamente c
Emodialisi (glucosio, NaCl, etc.)
inizio della dialisi
all’equilibrio
Dialisi all’equilibrio.
Si può calcolare la costante di affinità di un ligando (L)
per il suo recettore (R)
R
R-L
L
L
equilibrio
L
Filtrazione
Le particelle più piccole si muovono
attraverso la membrana assieme al fluido
sotto l’azione di una forza
• Microfiltrazione
0.1 - 10 μm
• Ultrafiltrazione
103 – 106 Dalton
• Nanofiltrazione (non interessa)
DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE:
APPLICAZIONI
• Eliminazione di molecole a basso PM (desalting)
• Sostituzione del tampone
• Concentrazione
• Studi di interazioni con ligandi (binding)
• Recupero di frammenti di DNA
• Rimozione di batteri (sterilizzazione)
• Funzioni terapeutiche (emodialisi)
Concentratori per ultrafiltrazione
Per far passare il solvente attraverso la membrana
si possono utilizzare:
• Pressione (in genere, azoto)
• Forza centrifuga (provette Centricon)
• Sostanze igroscopiche al di là della membrana
Ultrafiltrazione a pressione
In
Azoto
Cella con il
campione
Out
Valvola
Liquido di lavaggio
Ultrafiltrato
Membrana filtrante
Agitatore
Serbatoio
Diafiltrazione:
celle per campioni
Dischi per ultrafiltrazione
Per concentrare o desalificare soluzioni
diluite, si usano membrane di cellulosa.
La microstruttura idrofilica assicura la
maggiore ritenzione possibile
Con il minore adsorbimento di proteine,
DNA o altre macromolecole.
Per campioni più ricchi in proteine (es.,
siero) si usano membrane in
polieteresulfone (PES)
Filtrazione a flusso tangenziale (TFF)
Apparato per TFF
Filtrato
Pompa
valvola
ingresso
recuperato
Membrana
Filtrato
lunghezza
Recipiente del campione
Applicazioni della TFF
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Concentrare e desalificare proteine e peptidi.
Concentrare e desalificare acidi nucleici [DNA, RNA,
oligonucleotidi].
Recuperare e purificare anticorpi o proteine recombinanti da
terreni di cellule in coltura.
Recuperare e purificare DNA plasmidici da lisati cellulari o
DNA cromosomico da sangue intero.
Frazionare miscele diluite di proteine.
Chiarificare lisati cellulari o omogenati di tessuti.
Depirogenare (rimuovere endossine) da acqua, tamponi e altre
soluzioni.
Preparare i campioni prima di una cromatografia su colonna.
Raccogliere cellule.
Ricuperare o rimuovere virus.
Concentratore Centricon
Tappo di raccolta
Campione
Campione concentrato
Membrana ultrafiltrante
Campo
centrifugo
Serbatoio di raccolta
Filtrato
Sistema Amicon
Concentra 500 ul in 15 ul
Resa 90%
15-30 min a 14.000 g
Rimozione di sali
Concentratore statico
Pozzetti per i
campioni
Adsorbente
igroscopico
di cellulosa
Membrana
campione
Setto non
permeabile
Campione
concentrato
Concentratore statico:
applicazioni
• Concentrazione di campioni clinici (urina,
siero, CSF)
• Concentrazione di campioni per ricerca
• Aumento del titolo di anticorpi
• Rimozione di sali per ripetuta diluizione/
concentrazione
• Concentrazione di enzimi
Concentratore Savant SpeedVac
camera
centrifuga
trappola refrigerata
per il solvente
trappola per
pompa
vapori (opzionale)