Transcript Лекция 2

Краткий план лекционного мини-курса
«Спектроскопия ядерного магнитного
резонанса биомолекул»
Лекция 1
•Введение в спектроскопию ЯМР
•Принципы метода и его возможности для изучения биомолекул
•Аппаратура ЯМР
•Спектральные параметры и их связь со строением молекул
•Основные подходы и методики, используемые для изучения строения биомолекул
Лекция 2
•Методы отнесения сигналов в спектрах ЯМР к группам и атомам аминокислотных
остатков белков
•Установление структуры белков и нуклеиновых кислот методом ЯМР
•Изучение динамических свойств белков
•Методы ЯМР для изучения больших биомолекул
•Перспективы развития метода
Спектр ЯМР высокомолекулярного соединения
Спектр ЯМР-1H дигидрофолатредуктазы
человека (~20 кД)
Белок содержит 186 а.о. ~ около 1500
атомов водорода
Спектр
2D
NOESY
Спектр гетероядерной (15N-1H) корреляции
Расчет структуры биомолекул по данным ЯМР
Расчет структуры биомолекул по данным ЯМР
Метод последовательного отнесения сигналов
(Курт Вютрих)
1. Отнесение сигналов внутри спиновой
системы каждого аминокислотного
остатка – COSY и TOCSY
2. Попарное сочленение двух
аминокислотных остатков по белковой
цепи (последовательное отнесение) –
NOESY
A
B
Введение третьего измерения – 3D
спектроскопия ЯМР
Импульсная последовательность для эксперимента NOESY-HMQC
Введение третьего измерения – 3D
спектроскопия ЯМР
t 1, t 2, t 3
Фурьепреобразование
t1, t2, w3
Фурьепреобразование
t1, w2, w3
Фурьепреобразование
w1, w2, w3
3D спектроскопия ЯМР
F1
1H
13С
1H
F2
F3
1 mM 13C,15N-h-DHFR, 600
MHz
Метод последовательного отнесения сигналов
с использованием 3D спектроскопии
1. Отнесение сигналов внутри спиновой системы каждого
аминокислотного остатка – 3D HSQC-TOCSY
2. Попарное сочленение двух аминокислотных остатков по белковой
цепи (последовательное отнесение) – 3D HSQC-NOESY
Методы тройного резонанса (13С, 15N и 1H)
для отнесения сигналов ЯМР белка
R
R
R
H C H
H C H
N
C
C
N
C
C
H
H
O
H
H
O
î ñòàòî ê i-1
R
î ñòàòî ê i
HNCA
R
R
R
H C H
H C H
N
C
C
N
C
C
H
H
O
H
H
O
î ñòàòî ê i-1
î ñòàòî ê i
HN(CO)CA
R
Импульсная последовательность для
эксперимента HNCA
Методы отнесения боковых остатков
аминокислот
Ha
Hb2
Hg
Методы ЯМР, используемые для отнесения
сигналов белка
Название эксперимента
HNCA
Наблюдаемые атомы в 3D спектре
Cαi – Ni - HNi
Cαi-1 – Ni - HNi
HNCO
C’i-1 – Ni - HNi
HN(CO)CA
Cαi-1 – Ni - HNi
HCACO
C’i - Cαi - Hαi
CBCA(CO)NH
HBHA(CO)NH
Сα,βi-1 – Ni – HNi
Hα,βi-1 – Ni – HNi
CBCANH
Сα,βi-1 – Ni – HNi
Сα,βi – Ni – HNi
1H,15N
HNHB
Hβi – Ni - HNi
HNHA
Hαi – Ni - HNi
TOCSY-HSQC
Hαi – Ni - HNi
HCCH-TOCSY
Hαi – Cαi – Ciβ,γ,δ,ε - Hiβ,γ,δ,ε
Hβi – Cβi – Cγ,δ,εi - Hγ,δ,εi
Hγi – Cγi – Cδ,εi - Hδ,εi
Информация о вторичной структуре белка
Индекс химических сдвигов для определения
вторичной структуры белка
ЯЭО для определения вторичной структуры
белка
ЯЭО для определения вторичной структуры
белка
Укладка b-листов
Определение структуры биомолекул
методом ЯМР
Критерии качества структуры ЯМР
Ориентирование биомолекул относительно
внешнего магнитного поля
Qjk
Djk ~ 1/rjk3 (3cos2Qjk – 1)
Ориентирование биомолекул в разбавленных
растворах фосфолипидных бицелл
Требования к объекту (биомолекула) для его
исследования методом ЯМР
 Молекулярная масса до:
~35 кДа (600 МГц)
~55 кДа (800 МГц)
 Достаточная растворимость
~1 mM => 20 мг/мл для 20 кДа
 Стабильность
несколько дней при 10 – 30oC
 Высокая чистота и отсутствие агрегации
 Значительные количества
~ 5-8 мг для одного образца 20 кДа
 Высокий уровень экспрессии белка
Приблизительные денежные затраты на
получение одного образца белка
Изотопы
Мол.масса
белка
Цена за 1 л
среды M9
15N
5-15 кДа
30$
15N/13C
10-25 кДа
630$
2H/15N/13C
20-45 кДа
1250$
Приблизительные затраты времени для
определения структуры белка ~ 15 КДа
Сравнение методов ЯМР и РСА в
структурных исследованиях
Ограничения методов:
• Необходима хорошая
растворимость и
стабильность объекта;
• Мол.масса до ~ 50 кДа;
• Большие затраты
времени и средств
(изотопы 13С, 15N, 2D)
• Необходима хорошая
стабильность объекта и
его способность
кристаллизоваться;
• Требуется решение
проблемы фаз
Проблемы больших молекулярных масс
Пути решения проблем больших
молекулярных масс
Основные методы изучения больших
биомолекул: дейтерирование
Эффект дейтерирования на качество 3D
HNCA спектра
Основные методы изучения больших
биомолекул: TROSY
Спектр TROSY 15N,2D-i-пирофосфатазы
(гексамер 6х20=120 кДа)
800 MHz
Nature 418, 207 - 211
TROSY
CRINEPT-TROSY
Изучение динамических свойств биомолекул
NMR
papameters
Изучение быстрых движений белковой цепи
Релаксационные параметры, измеренные при
11.74 T (500 MHz) и 14.12 T (600 MHz)
Относительные амплитуды
движения белковой цепи,
рассчитанные по данным ЯМР
Измеряемые параметры ЯМР
Наблюдаемые параметры
Получаемая из них информация
Химические сдвиги 1H, 13C, 15N, 19F,
31P
Отнесение сигналов, вторичная структура
белка, НК и т.д.
Интегральные интенсивности
сигналов
Количество измеряемого компонента,
кинетические характеристики
Скорости обмена подвижных
протонов на дейтерий
Положение водородных связей, сворачивание
и разворачивание белка и НК
Константы спин-спинового
взаимодействия (через химическую
связь)
Характеристика хим. связей (1J и 2J),
диэдральные углы (3J), водородные связи (2hJ
и 3hJ)
Ядерные эффекты Оверхаузера
(взаимодейств. через пространство)
Расстояния между ядрами (1H – 1H < 5A),
динамические характеристики (1H – 15N и т.п.)
Ширины линий, времена релаксации
ядер, кросс-релаксация
Динамика, подвижность биомолекулы,
конформационные переходы
Константы диполь-дипольного
взаимодействия
Ориентация белковых доменов и биомолекулы
в целом, динамические эффекты
Диапазон химических сдвигов сигналов 1H, 13C, 15N, 31P и 17O
Требования к белку для его структурных исследований методом ЯМР
 Молекулярная масса до: ~35 кДа (600 МГц) или ~55 кДа (800 МГц)
 Достаточная растворимость: требуется около 1 mM => 20 мг/мл для 20 кДа
 Стабильность (должен выдержать несколько дней в растворе при темп. от 10
до 30oC)
 Высокая чистота и отсутствие агрегации
 Значительные количества ~ 5-8 мг для одного образца белка ~20 кДа
 Высокий уровень экспрессии, чтобы минимизировать затраты при
получении белка меченого изотопами 15N и 13C.
1.
2.
3.
Ресурсы Интернета, посвященные ЯМР
Портал SpectroscopyNow (потребуется регистрация для доступа к большинству
бесплатных ресурсов портала). http://www.spectroscopynow.com
На этом сайте, в частности, представлен курс теории ЯМР профессора James
Keeler (Кембридж, Великобритания) и полнотекстовый доступ к ряду статей в
журналах.
Сайты производителей спектрометров ЯМР – компания Bruker
(http://www.bruker-biospin.com/nmr), Varian (http://www.varianinc.com) и Jeol
(http://www.jeol.com/nmr/nmr.html)
Неоторые другие Web-ресурсы, псвященные теории ЯМР:
http://www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/molspec/nmr1.htm
http://www.cns.uni.edu/~macmilla/mcmurry/mcmurry_chapter_13
http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/nmr-main.htm
http://www.chem.ucla.edu/~webspectra/#Problems