Transcript 实验2.ppt
细胞损伤与保护实验 （二） • 设3组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复 • 用不同的实验方法检测、验证实验结果 实验内容 • 细胞电子显微镜检测 • 细胞活率测定 • 亚细胞结构的分离与鉴定 实验设计 昨天细胞传代: 1. （电镜）中午每班传细胞入含小盖片培养瓶3瓶 晚上1瓶正常、2瓶损伤 次日损伤2瓶中，其中1瓶损伤恢复 2. （活率）中午每组传细胞入96孔培养板9孔 晚上3孔正常、6孔损伤 次日损伤6孔中，其中3孔损伤恢复 3. （分离）每组传代细胞（1传2）25ml培养瓶2瓶 细胞电子显微镜检测 细胞电镜标本制备 原 理 光学显微镜无法看清小于0.2um的细 微结构，我们把这些细微结构称为亚显 微结构（submicroscopic structures） 或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要看 清这些结构，就必须选择波长更短的光 源，以提高显微镜的分辨率。 电子显微镜与光学显微镜 的结构，从原理上来说是相似 的，但也有不同之处。 • 首先不同的是用电子束（电子流）代替照明光 源。 • 其次，电镜使用的是电子透镜，而不是光学透 镜，电子透镜不是肉眼可见的物质透镜，它是 由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起 到透镜的作用。 • 第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标 本中不同结构中原子与电子发生碰撞后，造成 电子散射角度不同，使荧光屏上的电子强度也 相应不同。 电镜制样技术 由于电子束的穿透能力有限，为了获得较 高分辨率，需要使用超薄切片机制成厚度一般 仅为40～50nm的超薄切片。这就需要样品有 一定的刚性和韧性，为此，样品需要包埋在特 殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构， 因此超薄切片样品制备的第一步就是固定，其 后依次是包埋、切片和染色。 超薄切片的制备 1、固定：四氧化锇（OsO4）和戊二 醛等， 四氧化锇进行后固定。 2、包埋：环氧树脂和丙烯酸树脂等。 3、切片：玻璃刀用超薄切片机切片， 厚度40～50nm，切片收集在 铜网或镍网上，在电镜下观察。 4、染色：常用的染色液是醋酸双氧铀（易 染核 酸）和铅盐（易染蛋白质）。 结 果 • 在电子显微镜下观察 比对正常、损伤及损伤后恢复标本 • 照相 • 分析 • 总结 要 求 • 送标本 • 照片结果分析 细胞活率测定 MTT比色法 原 理 • 四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受Ｈ 原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。 活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶，能使外源性淡 黄色的 (MTT)还原成难溶于水的结晶，并沉 淀在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结 晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联 免疫检测仪，在波长492nm测定其光吸收值。 可间接反映活细胞的数量变化。 器材与试剂 • 器材：培养细胞(96孔细胞培养板) 酶标仪、移液抢、抢头等 • 试剂：5mg/ml MTT溶液 二甲亚砜（DMSO）溶液 DMEM培养液（高糖、无糖） 实验步骤 1、接种1.5×104/ml细胞于96孔板：每组9孔 2、每孔加200ul培养液：3孔正常（高糖）、 3孔损伤（无糖）、3孔损伤恢复（无糖 12h 有糖 ），37oC、5%CO2、饱和湿度下培养； 4、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养 液180ul 、再加 MTT溶液20ul，继续培养； 5、到2h测定时，每孔吸弃培养液， 加DMSO 溶液150ul，振荡1分钟； 6、酶标仪492nm波长处比色。 结 果 • 活细胞被染成紫色，而死细胞不被染色 • 记录酶标仪上光吸收值，记录结果 • 分析每组细胞生长情况 注意事项 • 每孔的细胞密度不能超出1x105 /ml ， 避免影响实验的区分度； • 高浓度血清会导致实验本底增高， 比色前尽量使血清浓度不超过10%。 亚细胞结构的分离与鉴定 细胞核的提取 原 理 细胞内各种细胞器质量不同，在同一 离心场内的沉降速度也不相同。根据这一 原理，常用差速离心法、密度梯度离心法 来分离各种细胞器。 分离的各种细胞器可以用组化等方法加 以鉴定。 器材与试剂 • 培养细胞 • 离心机、天平、离心管、显微镜、 滴管等、染色缸 • 消化液、0.075M KCl、0.25%蔗糖溶液、 甲醇固定液、Giemsa染液 操 作 收集细胞（消化法 ）—— 离心 (1000/min×5’ ) ——沉淀加0.075M KCl 4ml， 冲打，静置20min——离心(1500/min×10’ ) — — 取沉淀加蔗糖溶液4ml，打匀——离心 （2500/min×10’） ——取沉淀加少量固定液涂 片——酒精灯烤干——甲醇固定5 ’——Giemsa染 色5 ’——自来水冲洗——吸水纸吸干玻片（反 面）——显微镜10倍或40倍下观察（鉴定） 结 果 • 细胞核染成深兰色 注意事项 • 注意正确使用离心机（平衡、对称） • 正确使用显微镜 • PBS使用液临用前稀释 （PBS：Gimsa原液9：1） back 告 知 实验（三） 凋亡相关基因在不同细胞中表达差异检测 （免疫组化法） 时间：10月25日